“芩部丹”中三種單體對結核分枝桿菌作用下TLR2表達的影響

王莉新，吳燕燕，王 易

(上海中醫藥大學免疫學與病原生物學教研室，上海 201203)

中醫臨床驗方“芩部丹”(由黃芩、百部、丹參組方)系上海市龍華醫院邵長榮醫生創立的抗癆方藥。據已有資料顯示，“芩部丹”作為醫院制劑用于治療對抗結核化療藥物產生耐藥性的開放性肺結核患者，痰菌陰轉率可高達47%;治療難治性肺結核患者，痰菌陰轉率可達34.5%，均見較明顯的臨床療效［1］。

但此方除方中黃芩被證實具有一定的抑制結核桿菌生長作用外，其抗癆作用機制始終未能闡明。近年研究發現，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)通過對病原體相關分子模式(pathogenassociated molecular patterns，PAMPs)的識別而在固有免疫中發揮主導作用。已有研究表明這類受體在結核分枝桿菌入胞以及入胞后的轉歸中起重要作用［2］。其中TLR2與結核分枝桿菌入胞過程的關系尤為密切。故此實驗研究設想，“芩部丹”臨床藥效的發揮，可能與其所含成分對TLR2受體在宿主細胞上之表達有關。此實驗選取目前國內可獲取之黃芩、百部、丹參的主要提取物黃芩苷(baicalin)、對葉百部堿(tuberostemonine)、丹參多酚酸鹽(salvianolate)作為研究對象，以觀察這些成分對TLR2的影響作用，揭示“芩部丹”可能的抗結核免疫藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞及細菌人單核-巨噬細胞系U937，由上海交通大學醫學院免疫研究所惠贈;結核分枝桿菌H37Ra，由上海復旦大學遺傳學研究所惠贈。

1.1.2藥物單體及主要試劑黃芩苷、對葉百部堿單體購自上海同田生物技術有限公司;注射用丹參多酚酸鹽由上海綠谷制藥有限公司提供，100 mg·瓶-1;RPMI 1640培養基和胎牛血清均購自Gibco公司;佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)購自Promega公司;TRIzol reagent購自 Invitrogen公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit和 SYBR Premix Ex TaqTM均購自TaKaRa公司;PCR引物序列通過Oligo6軟件設計，并由生工生物工程(上海)有限公司合成;Anti-Human TLR2 FITC及對應的同型對照購自eBioscience公司。

1.2方法

1.2.1細菌培養用含體積分數為0.10的ADC 7H9培養液，在37℃恒溫培養箱中培養，每周觀察1次，一般1～2周可見瓶底有顆粒生長，10～15 d達到對數生長期。取對數生長期細菌用含有體積分數為0.10的胎牛血清RPMI 1640培養液重懸，調整濃度為 1 ×108·L-1。

1.2.2細胞培養U937細胞按常規方法用含有體積分數為0.10的胎牛血清RPMI 1640培養液，在37℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中培養。將U937細胞密度調整為5×108·L-1，經終濃度為100 nmol·L-1PMA刺激48 h后，分化為巨噬細胞(以鏡下細胞形態為確定依據)。棄去培養液，重新調整細胞密度為1×109·L-1，2 ml/孔鋪于6孔板中，設對照組(Control)、模型組(Model)、黃芩苷組(Baicalin)、對葉百部堿組(Tuberostemonine)、丹參多酚酸鹽組(Salvianolate)5組，每組3復孔。

1.2.3細胞感染模型的制備及藥物干預細胞和細菌按照上述方法培養后，于模型組及用藥組中，按照細胞∶細菌=10∶1加入細菌，將兩者共培養24 h，建立細胞感染模型。兩者共培養24 h后，換液，其中黃芩苷組、對葉百部堿組、丹參多酚酸鹽組換用含藥(終濃度為10 mg·L-1)的完全培養液繼續培養。待藥物作用8 h和24 h后，收集細胞，分別進行相關指標檢測。

1.2.4TLR2 mRNA表達水平檢測收集藥物作用8 h后細胞，常規提取細胞總RNA。取細胞總RNA 5 μg，按逆轉錄試劑盒說明將其逆轉錄為cDNA。以GAPDH為內參，分別進行熒光定量PCR反應。引物序列如下:TLR2(F:CTGGCCAAAGTCTTGATTGAT，R:GACATTCCGACACCGAGAG);GAPDH(F:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，R:GGTGCTAAGCAG TTGGTGGT)。反應條件為:95℃預變性30 s，1個循環;95℃變性5 s，60℃ 退火20 s，共40個循環。用Rotor-Gene 6.0.38軟件讀取各個樣本的Ct值，結果以 2-ΔΔCt值表示。

1.2.5TLR2蛋白表達水平檢測收集藥物作用24 h后細胞，以FACS法檢測TLR2蛋白表達水平。按照說明書加入適量Anti-Human TLR2，避光孵育30 min后，PBS洗兩次，以 200 μl含體積分數為0.02多聚甲醛的PBS重懸細胞。于BD公司流式細胞儀上進行檢測并讀取數據。

1.3統計學分析所有數據均以±s來表示，應用SPSS13.0軟件進行統計學處理，兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1“芩部丹”對TLR2 mRNA表達的影響實驗結果顯示，與對照組相比，模型組TLR2的mRNA表達水平降低(P＜0.05);與模型組相比，黃芩苷組、對葉百部堿組、丹參多酚酸鹽組TLR2的mRNA表達水平均增高(P＜0.05)。提示黃芩苷、對葉百部堿、丹參多酚酸鹽均可以糾正因結核分枝桿菌感染所造成之TLR2 mRNA表達下調的現象。見Fig 1，2。

Fig 1 The mRNA expression of TLR2 in U937

2.2“芩部丹”對TLR2蛋白表達的影響實驗結果顯示，與對照組相比，模型組TLR2的蛋白表達水平降低(P＜0.05);與模型組相比，黃芩苷組、對葉百部堿組、丹參多酚酸鹽組TLR2的蛋白表達水平均增高(P＜0.05)。提示黃芩苷、對葉百部堿、丹參多酚酸鹽均可以糾正因結核分枝桿菌感染所造成之TLR2蛋白表達下調的現象。見Fig 3，4。

Fig 2 The amplification curve of TLR2 by RT-QPCR

Fig 3 The protein expression of TLR2 in U937

以上研究結果均提示，“芩部丹”中3種單體黃芩苷、對葉百部堿、丹參多酚酸鹽的臨床抗結核療效，有可能與其提高巨噬細胞表面受體TLR2表達的作用相關聯。

3 討論

自1994年發現人類TLRs以來，TLRs因其對病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)的識別作用和介導多種免疫細胞激活的生物學效應，日益受到免疫學界的關注。并對其機制進行了較深入的研究。此外也發現了相當數量的藥物，尤其是中藥成分(多糖、黃酮、三環二萜類)對TLRs的表達具有調節作用［3］。這也促成了以TLRs為靶點治療感染性、免疫性疾病觀點的形成。TLR2與結核分枝桿菌入胞關系密切，并可識別結核分枝桿菌表面的阿拉伯糖甘露糖脂和磷脂酰肌醇甘露聚糖等，進而激活抗原提呈，調節固有免疫及適應性免疫［4-7］。有研究發現［8］，敲除小鼠 TLR2基因，然后讓小鼠感染結核分枝桿菌，結果發現在感染2 h內，中性粒細胞浸潤明顯減少，并且IL-6、TNF和IL-12 p40分泌亦下降，說明小鼠對結核分枝桿菌的易感性增加。同時，Harding等［9］發現結核分枝桿菌表面脂蛋白LpqH、LprG及LprA可與巨噬細胞表面TLR2結合，從而抑制APC MHCⅡ類分子表達，令APC提呈抗原的能力下降，使結核分枝桿菌在巨噬細胞內存活下來。這些現象均表明，TLR2在結核感染過程中起到了非常重要的作用。

Fig 4 The protein expression of TLR2 by FACS

王莉新等［10］在前期研究中發現丹參多酚酸鹽對人巨噬細胞表面的模式識別分子產生調節作用，而黃芩苷化學結構亦屬于能夠對固有免疫與炎癥反應產生調節作用的黃酮類。考慮到這些已觀察到或已被文獻報道的藥效作用，推論所選取的芩部丹單體黃芩苷、丹參多酚酸鹽有可能影響人巨噬細胞TLR2的表達。出于同一推論，此實驗亦曾對丹參酮ⅡA進行相同研究，結果未發現對TLR2表達的影響。此實驗研究還顯示黃芩苷可直接提高人巨噬細胞TLR2的表達(結果另文發表)，而丹參多酚酸鹽與對葉百部堿僅表現為可拮抗因結核分枝桿菌感染所造成之TLR2蛋白表達下調現象。提示此二者真正的作用部位可能是巨噬細胞內對TLR2表達的負反饋調節通路，今后將繼續就此開展深入研究。

中藥提取物用作體外細胞水平的藥效研究，其劑量確定是一個公認的難題，因為細胞培養液中所添加的藥物含量很難對應于臨床給藥劑量，本實驗參照抗腫瘤藥物敏感性試驗的相關文獻［11］。將單體含量按估算設置于臨床生藥用量范圍之內，采用可觀察到陽性結果的最低用藥量(因在不同提取物濃度作用條件下，靶細胞所測數據未呈現典型劑量-反應曲線)。其顯示的結果僅表明在設定實驗條件下，所選用的中藥單體可對人巨噬細胞表面TLR2的表達產生影響。同時，因尚未發現可引起類似生物學作用的合適化合物，故實驗未能設置陽性對照，但這并不影響實驗結果觀察的客觀性。

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