合成棕點湍蛙抗菌肽的抗菌活性評價

趙鐵華，程玉潔，李 哲

(河北師范大學藥物研究所，河北石家莊 050016)

棕點湍蛙抗菌肽是2006年河北師范大學劉敬澤教授從我國西南地區特產棕點湍蛙皮膚分泌液中分離取得的一種分子量為1706.96 u的單鏈多肽，氨基酸序列為Phe-Leu-Pro-Pro-Ser-Pro-Trp-Lys-Glu-Thr-Phe-Arg-Thr-Thr，具有明顯的抗菌活性，已經獲得國家發明專利保護［1］。為了探討合成抗菌肽與天然產物的一致性，為棕點湍蛙抗菌肽的應用和進一步的結構改造設計提供依據，本實驗進行了合成抗菌肽的初步活性分析。

1 材料與方法

1.1受試藥物合成棕點湍蛙抗菌肽:本實驗室Fmoc固相法合成;RP-HPLC分析純度為質量分數0.977;MS鑒定分子量1706.96 u，與預期相符。

硫酸慶大霉素注射液:石藥集團歐意藥業有限公司生產，批號:068100435。青霉素注射液:天津藥業集團新鄭股份有限公司生產，批號:201009070。硫酸鏈霉素注射液:樂山三九長征藥業股份有限公司生產，批號:20100610。

1.2抗菌活性測定

1.2.1培養基的配制營養肉湯培養基(杭州天和微生物試劑有限公司)15.2 g，加入400 ml蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，4℃保存備用。營養瓊脂培養基(杭州天和微生物試劑有限公司)16 g，加入400 ml蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，取15 ml滅菌培養基加至無菌培養皿，加蓋冷卻后制成瓊脂平板培養基，倒置，4℃保存備用。

1.2.2受試藥液的配制

1.2.2.1合成抗菌肽的配制 精密稱定合成抗菌肽400 μg，溶于 1 ml無菌注射用水，NaHCO3溶液(質量分數0.056)調 pH 為7～8，過孔徑0.22 μm微孔濾膜，4℃保存待用。

1.2.2.2抗生素的配制 精密稱取硫酸慶大霉素、青霉素、鏈霉素各10 μg，分別溶于1 ml無菌注射用水中，調pH為7～8，備用。

1.2.2.3合成抗菌肽與抗生素混合液的配制 精密稱取硫酸慶大霉素、青霉素、鏈霉素各5 μg，分別加入合成抗菌肽100 μg，溶于1 ml無菌注射用水，NaHCO3溶液(質量分數0.056)調pH為7～8，過孔徑0.22 μm微孔濾膜，4℃保存待用。

1.2.3試驗菌液的配制金黃色葡萄球菌(2株，菌號分別為26001/26、26002/6，中國藥品生物制品檢定所提供)和大腸埃希菌(2株，菌號分別為44102/2a3、44113/10，中國藥品生物制品檢定所提供)分別以肉湯培養基37℃18 h增菌，相同培養基10-3稀釋為實驗菌液。

1.2.4受試藥物對各試驗菌株最小殺菌濃度(MBC)的測定［2］分別取各受試藥液以營養肉湯培養基倍比稀釋至10個對倍稀釋濃度，每稀釋度藥液1 ml(各2個復孔)加至24孔細胞培養板，每孔加入對應試驗菌液50 μl，另設菌液和培養基對照孔。24孔板置37℃培養箱，18 h后觀察。取未見細菌生長各孔培養物50 μl，均勻涂至營養瓊脂平板培養基表面，平板倒置，37℃培養18 h后觀察。以菌落數少于5個(2個復孔的平均值)的藥物最高稀釋度為藥物對該細菌的最小殺菌濃度(MBC)。

2 結果

Tab 1結果顯示，合成抗菌肽對所試金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均有一定的殺菌作用，MBC值分別為200 mg·L-1和100 mg·L-1;慶大霉素、青霉素和鏈霉素對所試菌株殺菌作用較強，MBC值分別為1.25 mg·L-1至5 mg·L-1;合成抗菌肽與青霉素、鏈霉素聯合使用后抗菌作用增強，其中與青霉素聯合使用的效果明顯，對金黃色葡萄球菌的MBC值達到青霉素/合成肽 0.625 mg·L-1/25 mg·L-1。

3 討論

抗菌肽是一類以肽鍵為骨架結構，具有廣譜抗菌作用，廣泛分布的天然活性產物，具有結構新穎、活性高、耐藥性發生幾率小等多種優點［3］。無尾兩棲動物經長期進化，皮膚分泌液產生大量抵御所處環境病原微生物的天然活性短肽，是抗菌肽的重要天然產物庫［4］。其中棕點湍蛙抗菌肽由于結構簡單，藥理作用明顯，有可能作為前體化合物或直接開發為針對病原微生物感染的治療藥物［1］。

人工合成是解決棕點湍蛙抗菌肽天然資源來源和提取純化困難及其較高成本問題的有效方法之一。本實驗采用Fmoc固相方法合成了棕點湍蛙抗菌肽并進行了初步活性分析，結果顯示，單純使用合成產物的抗菌活性明顯低于天然產物(對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MBC值分別為23.1 mg·L-1和 4.3 mg·L-1)［1］。目前認為，氨基酸序列、空間構型，以及與此密切相關的陽離子和兩親特性是影響包括棕點湍蛙抗菌肽在內的陽離子抗菌肽活性的主要因素［5］。本實驗經HPLC和MS鑒定，合成抗菌肽與生物化學提取的天然產物一級結構相同。人工合成抗菌肽與天然產物比較活性的部分喪失是否與其空間構型的改變有關尚需進一步探討。在構效關系分析基礎上進行進一步的結構設計改造應該是保持甚至提高合成棕點湍蛙抗菌肽活性的必要工作。

在分析抗菌肽與經典抗生素作用機制基礎上，根據資料研究的提示［6］，本文進行了合成抗菌肽與經典抗生素的聯合應用實驗，結果表明，合成抗菌肽與青霉素、鏈霉素聯合使用后抗菌作用具有增強趨勢，其中與青霉素聯合使用效果較明顯。

Tab 1 The results of MBC about palm point turbulent frog antimicrobial peptides joint with traditional antibiotics(mg·L-1)

抗生素的作用機制主要是與細菌細胞膜或胞內特異受體結合，其中青霉素主要作用于革蘭染色陽性細菌，通過抑制細菌細胞壁四肽側鏈和五肽交連橋的結合而阻礙細胞壁合成。由于經典抗生素作用靶受體的限制，細菌很容易通過變異而產生耐藥性。資料表明，北京地區2005～2008年臨床監測金黃色葡萄球菌對含青霉素在內的所有β-內酰胺類抗生素臨床耐藥［7］。

抗菌肽主要作用機制與傳統的經典抗生素有較大差異。根據現有研究資料，抗菌肽主要通過其特有的陽離子型兩親α-螺旋或β-折疊結構作用在細菌的細胞膜上，破壞膜電勢，引起細胞質外泄［5］。作用機制分析，本實驗抗菌肽與經典抗生素的聯合應用實驗顯示的抗菌作用增強趨勢，可能是抗菌肽首先作用于細菌細胞膜上，增加膜的通透性，再由經典抗生素與特異性靶受體作用，進而增強抗菌肽和經典抗生素單獨使用的療效。由于抗菌肽不涉及與細菌等病原微生物特異性受體的結合，較少產生耐藥性［5］，本試驗采用的抗生素聯合應用方案可能有助于改善病原性細菌對傳統抗生素的耐藥性。

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