LC-MS/MS法測定人血漿中甘草次酸及其臨床藥代動力學研究

張 軍，陳 玟，居文政，劉 芳，鄒 沖

(南京中醫藥大學附屬醫院臨床藥理科，江蘇南京 210029)

甘草酸二銨(Diammonium glycyrrhizinate)是中藥甘草有效成分提取物甘草酸的銨鹽，有較強的抗炎、保護肝功能作用，作為治療肝炎的有效藥物廣泛應用于臨床。甘草酸在體內代謝為甘草次酸而發揮作用，這一轉化依賴腸道正常菌群水解，且進行緩慢［1-2］。甘草次酸血濃度 HPLC［8］、LC-MS 測定方法已有文獻報道［3-4，6］，但由于體內代謝物復雜，方法選擇性差;文獻［5］雖采用LC-MS/MS法測定甘草次酸血濃度，但其提取方法采用固相萃取，檢測成本高，且檢測方法的靈敏度不適合人體甘草酸治療劑量的藥代動力學研究。本研究采用LC-MS/MS方法測定甘草二酸銨膠囊口服給藥人血漿中甘草次酸濃度，旨在建立簡單、可靠、靈敏的甘草次酸分析測定方法，并用于甘草酸二銨口服給藥的人體藥代動力學研究。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑草酸二銨膠囊(江蘇正大天晴藥業股份有限公司生產，批號:080907，規格:50 mg/粒);甘草次酸對照品(由中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用，批號:110731-200615);潑尼松龍對照品(由中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用，批號:100153-199603);甲醇、乙腈、乙酸為色譜純;乙酸銨為分析純。

1.2儀器與液質條件API4000 LC/MS/MS聯用儀(美國應用生物系統公司)，色譜工作站:Analyst 1.4.2;梅特勒-托利多AE240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司);Biofuge PrimoR冷凍高速離心機(德國Heraeus公司);Drict-Q5超純水機(法國Millipore公司)。

液相條件:色譜柱:Agilent ZORBAX SB C18(3.0 mm×100 mm，5 μm);流動相 ∶甲醇 ∶乙腈∶醋酸銨緩沖液(5 mmol·L-1醋酸銨，0.2%冰醋酸)(15 ∶60 ∶25，V/V/V);流量:0.8 ml·min-1;柱溫:40℃。

質譜條件:多反應監測(MRM);電噴霧離子化;離子極性:負離子;離子選擇通道:甘草次酸，［MH］-，m/z 469.4/355.2;潑尼松龍，［M-H］-，m/z 358.9/279.9;離子源電壓:4 000 V;離子源溫度:500℃。

1.3受試者選擇20名男性健康受試者，經體檢合格，簽署知情同意書，并經倫理委員會審批同意。實驗前兩周及實驗期間未服用其它任何藥物。

1.4試驗設計受試者早晨空腹口服甘草酸二銨膠囊150 mg，用250 ml溫開水送服;服藥2 h后方可飲水，4 h后進統一標準餐。于服藥前及服藥后2、4、6、8、9、10、11、12、16、24、32、40、48、60 h 分別采血4 ml于肝素化試管中，分離出血漿，于-75℃保存待測。

1.5血漿樣品的處理于試管中精密加入血漿樣品0.5 ml、內標潑尼松龍溶液(0.0794 mg·L-1)30 μl，旋渦 10 s，加入 4 ml乙酸乙酯，旋渦振蕩 3 min，3 000 r·min-1離心10 min，吸取上層有機相 3.5 ml，40℃下空氣吹干，加入80%甲醇100 μl溶液復溶，旋渦 2 min，12 000 r·min-1離心 5 min，吸取上清液進行 LC-MS/MS 分析，進樣量5 μl。。

Fig 1 Representative MRM chromatograms of GA and IS in human plasma samples

1.6數據處理及統計分析將實驗所得的血藥濃度-時間數據采用DASver1.0軟件中“臨床藥理”模塊進行處理，計算各藥代動力學參數。

2 結果

2.1特異性在本實驗所采用的LC-MS/MS條件下，甘草次酸和內標互不干擾，峰形良好，無雜峰干擾，基線平穩，保留時間分別為3.65、0.83 min。

2.2介質效應考察取離心管數支，分別精密加入4.32，0.432，0.0864 mg·L-1的甘草次酸質控標準溶液20 μl，再分別加入內標溶液(0.0794 mg·L-1)30 μl，80% 甲醇溶液 50 μl旋渦 1 min，進樣分析，記錄峰面積A1。

另按“血漿樣品的處理”項下操作提取空白血漿數管，揮干后同上操作，記錄峰面積A2。

A2和A1的比值(A2/A1×100%)即為介質效應ME(%)。甘草次酸和內標介質效應分別在95.63% ～108.82%(n=3)和77.13%(n=9)。

2.3線性范圍取玻璃試管數支，加入空白血漿0.5 ml，分別精密加入不同濃度的甘草次酸標準溶液20 μl，旋渦10 s混勻，配成含甘草次酸濃度分別為1.50，3.00，6.00，12.0，24.0，48.0，96.0，192 μg·L-1的含藥血漿，按“血漿樣品處理”項下操作。計算甘草次酸峰面積As和內標峰面積Ai的比值f(f=As/Ai)，以峰面積比值f對血藥濃度C作回歸計算，得回歸方程:f=0.15×C+0.00684，r=0.99965，權重系數w=1/C×C。藥物濃度與峰面積間線性關系良好，線性范圍為1.50～192.0 μg·L-1，最低定量限為 1.50 μg·L-1。

2.4精密度與準確度考察日內精密度與日間精密度(3 d)。按標準曲線配制方法制備含甘草次酸分別為 3.456，17.28，172.8 μg·L-1的含藥血漿質控樣品，按“血漿樣品的處理”項下操作，根據隨行標準曲線求得實測濃度。實測濃度的RSD即為精密度，加入濃度和實測濃度的比值即為準確度，結果見Tab 1。

2.5提取回收率試驗同上操作制備含甘草次酸分別為 3.456，17.28，172.8 μg·L-1的含藥血漿質控樣品，按“血漿樣品的處理”項下操作，記錄峰面積A3。

提取回收率R% =A3/A2×4/3.5×100%，結果甘草次酸提取回收率在77.14%～83.64%(n=5)。

2.6穩定性試驗甘草次酸和內標標準溶液室溫放置4h，以甘草次酸峰面積和內標峰面積的比值計算，經與立即測定同濃度標準溶液進行比較，比值變化在95.68% ～103.75%之間;甘草次酸和內標標準儲備液冷藏(5℃)放置60 d，以峰面積計算，經與當天新稱量配制的標準溶液進行比較，甘草次酸和內標標準儲備液峰面積分別為新配制的98.63%和97.53%(重量經校正)，結果表明甘草次酸和內標溶液室溫放置4 h和冷藏(5℃)60 d穩定性良好。

Tab 1 Precision and accuracy of glycyrrhetic acid in human plasma

分別考察了含甘草次酸濃度分別為3.456，17.28，172.8 μg·L-1的含藥血漿質控樣品在室溫放置4 h以及經“血漿樣品處理方法”后的分析物放置24 h、-75℃放置20 d及反復凍融3次條件的穩定性，經實測濃度與加入濃度進行比較，濃度變化在88.70%～115%，結果表明甘草次酸在上述條件下均穩定。

2.7人體內藥代動力學研究20名健康受試者空腹口服甘草酸二銨膠囊150 mg后，血漿中甘草次酸平均濃度-時間曲線見Fig 2，其主要藥代動力學參數見Tab 2。

Fig 2 Average plasma concentration-time curves after a single oral administration of Diammonium Glycyrrhizinate Capsule to 20 healthy volunteers

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of glycyrrhetic acid in 20 healthy volunteers with a single oral administration of Diammonium Glycyrrhizinate Capsule(xˉ±s，n=20)

3 討論

參照文獻［3-4，6］建立的 LC-MS 甘草次酸檢測方法應用于人體血漿檢測中發現干擾較多，文獻［4，6］中血漿的內源性成分和代謝產物干擾了甘草次酸的測定;實驗考察了不同比例甲醇-水、乙腈-水及甲醇-乙腈-水作為流動相，發現本實驗所建立的流動相能有效地將甘草次酸和內源性成分及代謝產物分離。文獻［5］雖然建立了LC-MS/MS方法檢測血漿中甘草酸及甘草次酸，但沒有應用于臨床甘草次酸血藥濃度測定，其最低定量限10 μg·L-1不能滿足甘草次酸常規血藥濃度檢測，且血漿樣品處理采用了固相萃取，不適合于臨床藥代動力學大批量血漿樣品檢測。本研究建立的LC-MS/MS方法具有靈敏度高、干擾少、樣品處理簡單等特點可滿足臨床的藥代動力學研究。

甘草酸二銨是甘草酸的銨鹽，在體內迅速轉化為甘草酸，甘草酸在體內再代謝為甘草次酸而顯現藥理活性，這一轉化依賴腸道正常菌群水解，且進行緩慢［1，7］。腸內菌群在受到各種因素的影響后會出現一些變化，如個體胃腸道排空速度不同，胃腸道pH對藥物的吸收，飲食結構突然改變，抗菌藥物的使用，各種各樣的疾病，特別是消化道疾病，氣候變化，季節轉換，精神狀態不同等，盡管臨床試驗方案對諸如受試者的一般健康狀況、飲食、用藥等予以控制，但一些不定因素還是會導致腸內菌群存在個體差異，必然使個體對甘草酸的吸收、代謝和排泄存在差異。試驗結果甘草次酸AUC、Cmax、Tmax變異系數達到了30%左右和藥-時曲線的雙峰現象正體現了甘草酸體內變化的復雜性。臨床應用甘草酸二銨時，提示應視個體因素，包括疾病、飲食、合并用藥特別是抗生素應用等情況加以分析，制定合理的給藥方案。

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