經(jīng)前舒顆粒對郁怒反應(yīng)模型大鼠海馬腦區(qū)基因表達(dá)譜的影響

郭英慧，高 杰，徐凱勇，宋春紅，喬明琦

(山東中醫(yī)藥大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.實驗動物中心，山東 濟(jì)南 250355)

怒是影響人體健康的重要情志因素，其在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用和機(jī)制已成為研究的熱點之一。前期研究表明:憤怒和郁怒是人們發(fā)怒的兩種表達(dá)方式，分別對焦慮和抑郁及其相關(guān)癥狀產(chǎn)生起重要作用［1］。臨床回顧性流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示:郁怒與抑郁癥、心腦血管疾病、癌癥等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［2-3］。郁怒的產(chǎn)生及其誘發(fā)的情志病證的發(fā)病機(jī)制是一個復(fù)雜的過程，涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多個系統(tǒng)，具體作用機(jī)制尚不清楚［4］。用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)研究情志病證，這是當(dāng)今中西醫(yī)研究的重要課題。基因芯片技術(shù)以其快速、高效、高通量的特點已成為研究復(fù)雜疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制的有力工具之一。因此，本研究擬借助基因芯片技術(shù)，研究調(diào)肝方藥經(jīng)前舒顆粒對郁怒反應(yīng)模型大鼠海馬基因表達(dá)譜干預(yù)作用并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康♂Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，SPF級，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號 SCXK(魯)20050015。

1.1.2主要試劑和儀器TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司);經(jīng)前舒顆粒(主要成分:白芍、當(dāng)歸、柴胡、白術(shù)、丹皮、香附、甘草、郁金等藥組成。秦皇島市山海關(guān)制藥廠生產(chǎn)，生產(chǎn)批號:Z20053587);RT-PCR反應(yīng)試劑包括 M-MLVReverse、dNTP Mixture、rTaq、DNaseⅠ(大連TaKaRa生物公司)。引物合成由濟(jì)南博亞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。大鼠表達(dá)譜芯片Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array(上海生物芯片有限公司)，A260/A280測定儀，Spectrophotometer ND21000(NanoDrop);Agilent掃描儀。

1.2方法

1.2.1大鼠造模、分組及行為學(xué)評價依據(jù)文獻(xiàn)［5］制備憤怒、郁怒反應(yīng)大鼠模型。首先篩選曠場實驗、糖水偏好得分相近大鼠進(jìn)入實驗，社會隔離加居住入侵造模刺激1周，依據(jù)攻擊行為區(qū)分出憤怒、郁怒組大鼠模型，挑選出模型組中屬郁怒反應(yīng)大鼠，繼而將郁模組分為繼續(xù)造模組和模型給藥組。即實驗設(shè)置正常組、郁怒模型組(簡稱郁模組)、經(jīng)前舒給藥組(簡稱郁藥組)，每組10只。正常組、郁模組(造模同時)灌胃給予滅菌飲用水，郁藥組造模同時灌胃給予經(jīng)前舒顆粒，每天上午9:00灌胃給藥1次，給藥量0.1 ml·g-1體質(zhì)量(相當(dāng)于人臨床8倍劑量［6］，濃度1 ∶1，即1 ml藥液含原生藥1 g)，連續(xù)給藥7 d。采用曠場實驗和糖水偏好實驗對模型進(jìn)行評價［5］。

1.2.2大鼠腦組織取材評價實驗后，每只大鼠迅速斷頭、開顱、分離腦置于冰上培養(yǎng)皿中，無菌操作于冰上迅速剝離出海馬組織，分別放入1.5 ml離心管，置于液氮中冷凍保存。

1.2.3大鼠基因芯片的檢測

1.2.3.1組織總RNA提取 取凍存的大鼠海馬組織，按組別用組織勻漿機(jī)分別混合均勻，TRIzol試劑抽提海馬組織的總RNA，進(jìn)行紫外分析及電泳檢測。QIAGEN RNeasy Kit純化總RNA，測定其濃度后，-80℃保存。

1.2.3.2探針制備、芯片雜交掃描及數(shù)據(jù)提取 提取的RNA在干冰的保護(hù)下交上海生物芯片有限公司，待確認(rèn)質(zhì)量后參考Affymetrix基因芯片實驗操作手冊進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用熒光Cy3-dCTP標(biāo)記郁模組和郁藥組總RNA，用Cy5-dCTP標(biāo)記正常組的總RNA。然后用定量的Cy3和Cy5標(biāo)記的探針，進(jìn)行芯片雜交、洗滌、干燥。芯片結(jié)果用 Affymetrix掃描儀進(jìn)行掃描，GCOS1.4軟件讀取數(shù)據(jù)［7］。

1.2.3.3差異表達(dá)基因篩選與生物信息學(xué)分析 由上海生物芯片有限公司對掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)字化處理和數(shù)據(jù)統(tǒng)計;差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為Log-ratio≥0.8為上調(diào)基因，Log-ratio≤0.8為下調(diào)基因，P＜0.5。數(shù)據(jù)分析軟件采用博奧生物公司的GO分子功能注釋系統(tǒng)，將差異基因分子功能、生物過程、細(xì)胞成分進(jìn)行歸類，并利用公共數(shù)據(jù)庫(BioCarta、KEGG、GenMApp、NCBI Gene Bank等)對差異表達(dá)基因涉及的調(diào)控路徑進(jìn)行檢索分析［7］，同時參閱大量相關(guān)文獻(xiàn)。

1.2.4RT-PCR實驗分別取3只正常組、郁模組和郁藥組大鼠的海馬組織，提取RNA后，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，采用Primer 3軟件，選取基因芯片檢測結(jié)果中Htr3b和GABABR2基因設(shè)計引物，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行 PCR 驗證［8］。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，各項檢測數(shù)據(jù)以±s記錄。采用t檢驗和χ2檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1曠場實驗及糖水偏好實驗由Fig 1可見:造模刺激1周后郁怒大鼠模型曠場實驗得分上升(P＜0.05)，而糖水偏好系數(shù)則下降(P＜0.05);藥物干預(yù)后上述指標(biāo)均得到一定程度恢復(fù)，但與郁模組比較差異無顯著性(P＞0.05)。

Fig 1 Open-field test(A)and sucrose preference test(B)results of control，anger-in model，Jingqianshu treatment rats(ˉx ± s，n=10)

2.2組織樣品RNA檢測和芯片檢測質(zhì)量判定所提取總RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測，OD260nm/OD280nm比值介于1.9～2.1;經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，28 S、18 S兩條帶清晰，且無拖尾現(xiàn)象，提示RNA完整性較好，總RNA濃度、純度及完整性符合實驗要求(Fig 2)?；蛐酒瑱z測結(jié)果顯示，Cy3/Cy5比值正常，芯片檢出率在0.99以上，均一性良好，符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，信號強(qiáng)度達(dá)到要求。

Fig 2 RNA electrophoresis results of control，anger-in model，Jingqianshu treatment.

2.3差異表達(dá)基因的功能分布及其調(diào)控路徑

2.3.1各組差異表達(dá)基因的功能分布按Gene Ontology功能分類標(biāo)準(zhǔn)對差異表達(dá)基因進(jìn)行檢索分類，由于某些差異表達(dá)基因并非僅有一個功能或僅通過一條調(diào)控路徑。經(jīng)查基因庫，造模組與正常組比較共檢出63個表達(dá)上調(diào)基因和153個表達(dá)下調(diào)基因，涉及蛋白結(jié)合活性等分子功能的基因259個，有關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程的基因281個，涉及膜組分等細(xì)胞成分的基因204個。郁藥組與郁模組比較共檢出127個不同差異表達(dá)基因，其中郁模組/正常組上調(diào)而郁藥組/正常組基因下調(diào)基因有55個，郁模組/正常組下調(diào)而郁藥組/正常組基因上調(diào)基因有72個，主要有各類激素受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、代謝酶、離子通道蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、細(xì)胞因子受體等。選取部分郁藥組與郁模組比較差異表達(dá)基因進(jìn)行分子功能注釋，見Tab 1。

2.3.2各組差異表達(dá)基因的調(diào)控路徑利用KEGG等數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因涉及的調(diào)控路徑進(jìn)行檢索分析發(fā)現(xiàn)，多基因可通過一條調(diào)控路徑。造模組與正常組比較發(fā)現(xiàn)差異基因共涉及124條調(diào)控路徑，最多者6個基因/路徑，為神經(jīng)活化配體-受體交互作用路徑;其次為4個基因/路徑和3基因/路徑，為甘油磷脂代謝路徑和促分裂原活化蛋白激酶路徑。另外還有一基因通過多條調(diào)控路徑情況，最多的為10條路徑/基因，分別是核糖體蛋白S6激酶(Rps6kb1)和磷脂酶Ce1(Plce1)。郁藥組與郁模組比較發(fā)現(xiàn)差異基因與80條調(diào)控路徑有關(guān)，通過調(diào)控基因最多的為4基因/路徑，為神經(jīng)活化配體-受體交互作用路徑和離子轉(zhuǎn)運調(diào)控路徑。同時Rps6kb1和Plce1基因也是涉及調(diào)控路徑最多的基因，為10條路徑/基因。

2.4RT-PCR驗證基因芯片檢測結(jié)果選擇基因芯片結(jié)果提示的有差異表達(dá)的Htr3b和GABABR2基因進(jìn)行RT-PCR實驗，Htr3b和GABABR2基因表達(dá)結(jié)果與基因芯片數(shù)據(jù)基本一致(Fig 3)，說明基因芯片檢測結(jié)果是可靠的。

3 討論

Tab 1 Selected genes differentially expressed in the hippocampus from Jingqianshu treatment and anger-in model rat

Fig 3 Electrophoresis results of Htr3b(A)and GABABR2(B)RT-PCR test from rat hippocampus

居住入侵及社會隔離是社會壓力應(yīng)激領(lǐng)域經(jīng)典造模方法，曠場實驗和糖水偏好為動物行為學(xué)領(lǐng)域經(jīng)典評價方法，國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界應(yīng)用以上方法已成功制備出抑郁癥、經(jīng)前煩躁易怒等多種情緒類疾病動物模型［5］。本實驗采用居住入侵結(jié)合社會隔離的方法制備憤怒、郁怒情緒大鼠模型［8］。與正常組相比，郁模組大鼠曠場實驗總分明顯上升，而糖水偏好系數(shù)顯著下降，初步判定模型制備成功，用藥干預(yù)后負(fù)性情緒能得到一定程度地改善，但郁藥組與郁模組比較差異未見顯著性(P＞0.05)，這與模型用藥時間較短有關(guān)，但仍能很大程度上說明調(diào)肝方藥經(jīng)前舒顆粒能夠糾正郁怒反應(yīng)模型大鼠行為學(xué)變化。

中藥復(fù)方是以多組分、多靶點發(fā)揮效應(yīng)，其對基因的調(diào)控可能是通過群體基因表達(dá)實現(xiàn)?；蛐酒哂写笈?、同時篩選和整體信息處理的性質(zhì)，本研究利用此特點對經(jīng)前舒顆粒干預(yù)郁怒大鼠海馬腦區(qū)基因表達(dá)譜進(jìn)行初步分析，了解該方應(yīng)用后的一些基因反應(yīng)模式，以期從基因水平上探索其可能的藥物靶點及作用機(jī)制。結(jié)果顯示該方可使郁模組海馬組織中的較多基因產(chǎn)生差異性表達(dá)，提示方中的藥物作用靶點較多，是通過整體調(diào)節(jié)基因的高/低表達(dá)發(fā)揮藥物的作用。在上調(diào)或下調(diào)的一些已知基因中，其功能與保護(hù)神經(jīng)元、抑制細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)突觸傳遞保護(hù)、穩(wěn)定Ca2+通道、拮抗缺氧等有關(guān)，這些基因或是藥物作用靶點或是藥物信號傳導(dǎo)通路上的某個環(huán)節(jié)。差異表達(dá)基因多屬于神經(jīng)活化配體—受體交互作用、甘油磷脂代謝和促分裂原活化蛋白激酶等調(diào)控路徑，說明這些調(diào)控路徑與經(jīng)前舒顆?？赡艿乃幬锔深A(yù)分子機(jī)制密切相關(guān)，這可能是該方干預(yù)郁怒情緒反應(yīng)作用的基礎(chǔ)。

舉以下幾個基因為例討論:① Htr3b(NM_022189)和催乳素受體Prlr(NM_001034111)基因，有報道Htr3b受體參與調(diào)控中樞性惡心、嘔吐和應(yīng)激性腸綜合征等過程，基因多態(tài)性與女性嚴(yán)重抑郁癥密切相關(guān)。Prlr受體在泌乳、生長發(fā)育、內(nèi)分泌行為、免疫調(diào)節(jié)等生理過程中發(fā)揮重要生理功能［9-10］。經(jīng)前舒顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)這些激素及神經(jīng)遞質(zhì)受體，進(jìn)而參與神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫系統(tǒng)功能失調(diào)調(diào)節(jié)過程，這與以往報道慢性憤怒應(yīng)激與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能失調(diào)密切相關(guān)等研究結(jié)果相符［8，11］。② 成纖維細(xì)胞生長因子受體 Fgfr2(NM_001109892)和代謝型谷氨酸受體 Grm8(NM_022202)，大量研究表明成纖維細(xì)胞生長因子bFGF可通過與受體Fgfr2特異性結(jié)合，激活酪氨酸激酶，影響谷氨酸受體蛋白、鈣結(jié)合蛋白等的表達(dá)而穩(wěn)定Ca2+通道，拮抗缺氧、興奮性氨基酸、自由基等的損害，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展，從而保護(hù)神經(jīng)元［12-13］。Grm8(NM_022202)在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成、可塑性改變以及學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知的突觸傳遞過程中發(fā)揮重要作用，其功能異?？赡軐?dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的損害［14］。經(jīng)前舒顆?？芍?Fgfr2、Grm8表達(dá)上調(diào)，可能通過促進(jìn)抗氧化應(yīng)激，增加Grm8突觸前抑制，減少谷氨酸的釋放，對海馬神經(jīng)元起到保護(hù)性效應(yīng)，起到抑制其凋亡作用。③糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件結(jié)合蛋白Gmeb2(NM_031803)，海馬是糖皮質(zhì)受體含量最高的腦區(qū)，應(yīng)激時海馬極易受到高濃度的糖皮質(zhì)激素選擇性的攻擊，導(dǎo)致海馬整體受損，突觸可塑性降低，神經(jīng)元萎縮、丟失，并進(jìn)一步影響到學(xué)習(xí)記憶等高級功能［15-16］。經(jīng)前舒顆?？缮险{(diào) Fgfr2、Gmeb2基因表達(dá)，推測可能通過拮抗缺氧、自由基的損害，減少游離糖皮質(zhì)激素含量，從而對應(yīng)激型海馬神經(jīng)元起保護(hù)作用。

郁怒情緒及與其密切相關(guān)的情志病證的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，本研究雖初步證實經(jīng)前舒顆?？赏ㄟ^改變郁怒情緒大鼠海馬腦區(qū)一些基因反應(yīng)模式，能夠部分糾正模型大鼠行為學(xué)變化，但很大部分基因功能還遠(yuǎn)未完全搞清楚。在后續(xù)的研究中，我們將對芯片結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗證，并利用相關(guān)情志病證動物模型或精神藥理學(xué)相關(guān)研究來佐證基因芯片發(fā)現(xiàn)的一些陽性結(jié)果，為深入探討與郁怒情緒密切相關(guān)的情志病證的發(fā)生和發(fā)病機(jī)制提供基本依據(jù)和研究方向。

［1］Bridewell W B，Chang E C.Distinguishing between anxiety，depression，and hostility:relations to anger-in，anger-out，and anger control［J］.Pers Individ Dif，1997，22(4):587-90.

［2］Julkunen J，Gustavsson-Lilius M，Hietanen P.Anger expression，partner support，and quality of life in cancer patients［J］.J Psychosom Res，2009，66(3):235-44.

［3］竇學(xué)俊，高冬梅，王婧婧，等.護(hù)士人群怒表達(dá)方式及相關(guān)情志病證流行病學(xué)調(diào)查［J］.中醫(yī)雜志，2009，12:1093-5.

［3］Dou X J，Gao D M，Wang J J，et al.Epidemiological investigation of nurses’emotional diseases related to anger and its expression［J］.J Trad Chin Med，2009，12:1093-5.

［4］易正輝，方貽儒，禹順英.抑郁癥腦組織基因差異表達(dá)研究進(jìn)展［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2010，36(1):56-9.

［4］Yi Z H，F(xiàn)ang Y R，Yu S Y.The research progress of differential expression genes of depression brain［J］.Chin J Nerv Ment Dis，2010，36(1):56-9.

［5］Wei S，Zhang H Y，Gao J，et al.Impact of social isolation and resident intruder stress on aggressive behavior in the male rat［J］.Neural Regen Res，2010，5(15):1175-9.

［6］馮 玉，張惠云.經(jīng)前舒顆粒對經(jīng)前期綜合征肝氣郁證大鼠大腦皮層雌激素受體表達(dá)的影響［J］.中藥藥理與臨床，2010，26(2):71-3.

［6］Feng Y，Zhang H Y.Effects of Jingqianshu granule on the expression of estrogen receptor(ER)of PMS model rats with liver-qi stagnation［J］.Pharmacol Clin Chin Mat Med，2010，26(2):71-3.

［7］Li R Y，Zhang Q H，Liu Z，et al.Effect of short-term and longterm fasting on transcriptional regulation of metabolic genes in rat tissues［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，344(2):562-70.

［8］王杰瓊，張惠云.憤怒、郁怒反應(yīng)模型大鼠海馬5-HTR2C的基因表達(dá)［J］.中國藥理學(xué)通報，2011，27(3):325-8.

［8］Wang J Q，Zhang H Y.The expression of 5-HTR2C in the hippocampal of the anger-in and anger-out animal model［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(3):325-8.

［9］Férézou I，Cauli B，Hill E L，et al.5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons［J］.J Neurosci，2002，22(17):7389-97.

［10］Krzywkowski K，Davies PA，F(xiàn)einberg-Zadek PL，et al.High-frequency HTR3B variant associated with major depression dramatically augments the signaling of the human 5-HT3AB receptor［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(2):722-7.

［11］詹向紅，李 偉，趙君玫，等.慢性憤怒應(yīng)激對大鼠衰老進(jìn)程及其神經(jīng)內(nèi)分泌免疫機(jī)制的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，25(1):111-3.

［11］Zhan X H，Li W，Zhao J M，et al.Effects of chronic anger stress on rats aging process and neuroendocrine-immune mechanism［J］.China J Tradi Chin Med Pharma，2010，25(1):111-3.

［12］Gaughran F，Payne J，Sedgwick P M，et al.Hippocampal FGF-2 and FGFR1 mRNA expression in major depression，schizophrenia and bipolar disorder［J］.Brain Res Bull，2006，70(3):221-7.

［13］Rosenblatt S，Irikura K，Caday CG，et al.Basic fibroblast growth factor dilates rat pial arterioles［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1994，14(1):70-4.

［14］Nakanishi S，Nakajima Y，Masu M，et al.Glutamate receptors:brain function and signal transduction［J］.Brain Res Rev，1998，26(2-3):230-5.

［15］Joel sM，Karst H.Effects of chronic stress on structure and cell function in rat hippocampus and hypothalamus［J］.Stress，2004，7(4):221-31.

［16］Zhang L，Kokkonen G，Roth G S.Identification of neuronal programmed cell death in situ in the striatum of normal adult rat brain and its relationship to neuronal death during aging［J］.Brain Res，1995，677(19):177-9.