金雀異黃素對CIA大鼠成纖維樣滑膜細胞增殖、凋亡及其機制的研究

張 育，張學增，沈維干，許金鑫，馬瑩瑩

(1.江蘇揚州大學臨床醫學院，江蘇揚州 225001;2.山東青島衛生學校，山東 青島 266071)

類風濕性關節炎是一種常見的可致殘的慢性炎癥性疾病，其最主要的病理表現為滑膜炎，滑膜細胞呈腫瘤細胞樣增殖并產生多種炎癥因子，如IL-1和TNF-α等。金雀異黃素(Genistein，Gen)又稱為染料木素，是一種來源于豆類植物和齒類植物異黃酮類化合物，其化學名為4，5，7-三羥基異黃酮。體外實驗研究表明Gen可能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖，故Gen已經成為廣受各界關注的一種非營養素成分［1-2］。AKT又被稱為蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT信號傳導通路中的關鍵分子。磷酸化的AKT誘發的細胞生長，經多種途徑促進細胞存活，是重要的抗凋亡調節因子［3］。近來許多研究表明［4-5］，炎癥因子能夠通過活化AKT信號轉導通路活化多種炎性細胞，參與RA疾病的發生與發展。我們采用體外細胞培養技術，擬研究Gen對CIA大鼠成纖維樣滑膜細胞中AKT及其磷酸化蛋白p-AKT表達的影響，探討Gen調節CIA大鼠成纖維樣滑膜細胞增殖、凋亡蛋白表達與其影響AKT表達和磷酸化蛋白p-AKT表達的關系。

1 材料與方法

1.1實驗細胞來源用Ⅱ型膠原建立CIA大鼠動物模型，取滑膜細胞原代培養，通過流式細胞術檢測第4代細胞純度達到頂峰，故用第4代細胞進行實驗。

1.2實驗試劑和藥物Gen購自Sigma公司(相對分子質量為270.2，純度不低于99%);小牛血清購自杭州四季青公司;DMEM培養基購自美國GIBCO公司;二甲基亞砜(DMSO)購自上海生工生物工程有限公司;5×loading buffer購自南通碧云天生物公司;Rabbit Anti-bax和Rabbit Anti-bcl-2抗體購自美國eBioscience公司;AKT單克隆抗體、p-AKT多克隆抗購自美國Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠二抗、兔抗小鼠二抗及DAB顯色液為武漢博士德生物工程有限公司的產品;小鼠抗大鼠GAPDH購自北京博奧森生物科技有限公司。其余試劑均為進口分裝或市售分析純。

1.3實驗方法

1.3.1CIA大鼠FLS的培養CIA大鼠FLS養于DMEM培養液(含15%小牛血清，100 kU·L-1青霉素，100 g·L-1鏈霉素)中。上述細胞均放置于37℃、5%CO2培養箱中常規培養。2～3 d換液1次。取第4代對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.2大鼠FLS的鑒定用流式細胞術檢測CIA大鼠FLS表面標記VCAM-1，觀測細胞的純度。

1.3.3實驗分組實驗分為正常大鼠FLS組、CIA大鼠FLS組、CIA大鼠FLS+DMSO(濃度為0.1%)組、CIA大鼠FLS+不同濃度的Gen(濃度分別為50、100、200 μmol·L-1)組。

1.3.4MTT法檢測Gen抑制FLS增殖情況接種細胞:用0.25%胰蛋白酶消化對數生長期的CIA大鼠FLS以及正常大鼠FLS，用含15%小牛血清的DMEM培養液懸浮細胞，計數后分別接種于96孔培養板，每孔約5 000個細胞，設6個復孔。將培養板移入細胞培養箱中，在37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，CIA大鼠FLS組分別加入不同濃度Gen，使其終濃度分別為0、50、100、200 μmol·L-1。分別培養24、48和72 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 g·L-1)，于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養4 h后，終止培養。棄上清，每孔分別加入50 μl DMSO，輕輕振蕩10 min，充分溶解結晶。酶標儀(波長490 nm)測定各孔的OD值，記錄結果，實驗重復3次。

1.3.5Western blot法檢測Gen對CIA大鼠關節FLS bcl-2和bax表達的影響用0.25%胰蛋白酶消化對數生長期CIA大鼠FLS以及正常大鼠FLS，用含15%小牛血清的DMEM培養液配成單個細胞懸液，接種于?10 cm的細胞培養皿。按以上分組進行加藥，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，72 h后，終止培養。重懸計數，移入1.5 ml EP管，離心棄去培養基，用預冷的PBS洗滌細胞2次。離心去上清，將EP管口倒置于吸水紙上吸干殘留液體。按5×106個細胞加入0.1 ml RIPA強裂解液，并劇烈振蕩后置冰上120 min〔裂解液在使用前按每毫升加入10 μl PMSF(100 mmol·L-1)配制，冰浴預冷后使用〕。4℃ 12 000 r·min-1離心10 min，將上清轉移至另一1.5 ml EP管中。每個樣本中各取少量蛋白，通過BCA法測定蛋白樣品濃度，并將蛋白樣品濃度調成一致，每組取50 μg的總蛋白按1∶4加入5×SDS上樣緩沖液沸水浴中加熱5 min，然后進行SDS-PAGE電泳，轉膜，0.3%的 BSA封閉1 h加入bax、bcl-2和內參GAPDH抗體4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃與膜孵育1 h，TBST洗滌3次，DAB顯色液A、B、C液各一滴加入1 ml三蒸水中混勻取1 ml將膜浸與其中5 min流水沖洗。掃描后用Quantity One灰度分析軟件進行光密度計算。以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH灰度值的比值作為相應目的蛋白的表達量指標。每個樣本至少重復3次。

1.3.6Western blot法檢測Gen對CIA大鼠滑FLS AKT及p-AKT表達的影響細胞分組及處理如“1.3.5”所述。

1.4統計學處理所有統計學處理均在SPSS10.0、Excel 2003 軟件中完成。

2 結果

2.1滑膜細胞的形態及鑒定對原代培養的FLS進行貼壁分離純化，細胞培養成功，倒置顯微鏡觀察細胞形態結果見Fig 1，從圖中可以看到兩種形態細胞:長梭行及多角形，FLS常呈單個排列。培養3～4 d后平鋪貼壁生長。對CIA大鼠FLS進行流式細胞術鑒別結果顯示如Fig 2。

Fig 1 Morphology of primary cultured rat fibroblast–like synoviocytes(×400)

Fig 2 Detection of VCAM-1 on CIA rat fibroblast-like synoviocytes by flow cytometry

2.2MTT法檢測Gen抑制細胞增殖為了觀察Gen對大鼠成纖維樣滑膜細胞增殖的影響，本研究MTT的方法分檢測24，48和72 h 3個時間點細胞增殖情況，細胞增殖結果由Tab 1可見，造模后CIA大鼠成纖維樣滑膜細胞增殖程度明顯高于正常組大鼠成纖維樣滑膜細胞，50、100 和 200 μmol·L-1的Gen均可以抑制CIA大鼠成纖維樣滑膜細胞增殖，差異有顯著性(P＜0.01)，且成劑量時間依賴性關系，DMSO對CIA大鼠成纖維樣滑膜細胞增殖無影響。結果見Tab 1。

Tab 1 Gen-suppressed FCS proliferation by MTT assay(±s，n=6)

Tab 1 Gen-suppressed FCS proliferation by MTT assay(±s，n=6)

A is the synovial cells of CIA rats and the other results is the multiples of A，*P ＜0.01

Group Dose/μmol·L-1 Absorbance 24 h 48 h 72 h Synovial cells of normal rats - - 0.82 ±0.024* 0.97 ±0.021* 1.36 ±0.062 DMSO/%*A 1.00 ±0.036 1.35 ±0.01 2.12 ±0.031 A+DMSO - 0.1 1.00 ±0.055 1.35 ±0.023 2.13 ±0.133 A+gen 1 50 ≤0.1 0.87 ±0.036* 1.14 ±0.024* 1.67 ±0.124*A+gen 2 100 ≤0.1 0.83 ±0.013* 1.01 ±0.023* 1.40 ±0.063*A+gen 3 200 0.1 0.79 ±0.041* 0.89 ±0.029* 1.10 ±0.04--*

2.3Western blot法檢測Gen對CIA大鼠關節FLS bcl-2和bax表達的影響Bcl-2家族多定位于線粒體外膜、核膜以及內質網膜的胞漿面，分為促凋亡蛋白(bax)和抗凋亡蛋白(bcl-2)，不同濃度的Gen作用FLS細胞72 h后，提取FLS細胞總蛋白，采用Western blot檢測上述分子的變化。結果如Fig 3所示:①與正常組比較，模型組大鼠關節FLS細胞bax蛋白表達水平明顯降低，而模型組大鼠關節FLS細胞bcl-2蛋白表達水平較正常組大鼠關節FLS細胞明顯增高，差異均有顯著性(P＜0.05);用藥組bax表達量均低于正常組，其中Gen1和Gen2與正常組差異有顯著性(P＜0.05)，Gen3組bax表達量接近于正常組(P＞0.05);Gen1和Gen2組bcl-2表達高于正常組，其Gen2與正常組比較差異有顯著性(P＜0.05)，高劑量組bcl-2表達低于正常組，差異有顯著性(P＜0.05)。②與模型組比較，不同濃度的Gen作用細胞后，隨著藥物濃度的增加，與模型組比較bax蛋白表達均有不同水平的上調，其中Gen2組和Gen3組與模型組比較差異有顯著性(P＜0.05)，Gen1組與模型組比較差異無顯著性(P＞0.05);用藥組bcl-2蛋白表達均有不同水平的下調，與模型組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。

Fig 3 Expression of bax，bcl-2，β-actin in rat FLS

Fig 4 Expression of AKT，AKT in rat FLS

2.4Western blot法檢測Gen對CIA大鼠FLS中AKT及p-AKT表達的影響不同濃度Gen作用CIA大鼠關節FLS 72 h后AKT、p-AKT表達的高低，結果如Fig 4所示:①與正常組比較，造模組及用藥組AKT表達量均無差異(P＞0.05);造模組p-AKT表達量高于正常組，且差異有顯著性(P＜0.05);各Gen用藥組p-AKT蛋白的表達均高于正常組，Gen1和Gen2組與正常組比較差異有顯著性(P＜0.05)，Gen3組與正常組p-AKT表達相當(P＞0.05)。②與模型組比較，各用藥組AKT表達無差異(P＞0.05);不同濃度Gen用藥組p-AKT蛋白的表達均低于模型組，差異均有顯著性(P＜0.05)，且p-AKT表達的降低與Gen呈劑量依賴性。

3 討論

Gen是大豆異黃酮的主要活性成分，是一種天然植物雌激素，長期以來引起人們廣泛的關注。1987年Akiyama等首次發現Gen是一種受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑，可以抑制血管內皮細胞和腫瘤細胞的增殖［6-7］，體內外實驗及流行病學結果均顯示，Gen通過抑制腫瘤細胞周期蛋白表達、誘導細胞分化、誘導細胞凋亡作用［8］。

RA患者的FLS呈腫瘤細胞樣生長，即表現為異常增殖、凋亡受阻并產生大量的炎性細胞因子，因此，FLS作為一個治療 RA的靶點已受到廣泛關注［9］。FLS在RA的發病過程、慢性炎癥的維持和軟骨與骨的破壞等方面發揮著重要的作用，因此我們研究FLS的生物學功能對于探討RA的發病機制及篩選抗RA藥物具有重要意義。VCAM-1是目前常用的鑒別FLS的特異性的標記物之一［10］。我們用流式法檢測培養的原代滑膜細胞表面VCAM-1的表達發現，培養的原代滑膜細胞VCAM-1的表達在第1代約20%，第2代約50%左右，培養至3代約為70%，第4代的細胞VCAM-1的表達為85.5%，第4代的滑膜細胞中大部分為FLS，與資料報道結果一致。故我們選取第四代FLS做為研究對象進行實驗研究。

作為bcl-2家族中一對凋亡相關基因，bcl-2/bax的平衡在細胞的凋亡過程中起重要調節作用，在細胞線粒體中，bcl-2家族蛋白通過與其他凋亡蛋白的相互協同作用，調控線粒體的結構與功能，發揮著細胞凋亡主開關的作用。bcl-2家族蛋白在凋亡中的主要功能就是直接調節線粒體膜的通透性，從而調節不同凋亡因子的釋放過程，發揮其抗凋亡或促凋亡作用。bax是bcl-2家族中的促凋亡基因，其高表達可促進細胞凋亡，而bcl-2是一種原癌基因，其高表達可以抑制細胞的凋亡過程。我們采用Western blot方法檢測Gen對CIA大鼠關節FLS凋亡蛋白表達是否有影響，研究結果顯示，Gen能夠調節CIA大鼠關節FLS凋亡蛋白bcl-2和bax的表達，用藥后CIA大鼠關節FLS凋亡調節蛋白bcl-2表達降低，而bax表達升高，且隨Gen劑量的增大，其作用增強，提示Gen在抑制細胞增殖同時能夠誘導CIA大鼠關節FLS的凋亡，進一步加強了對FLS增殖的抑制作用。

信號途徑是重要的細胞調控通路，各種影響因素及細胞因子均是通過不同的信號轉導通路調節細胞的生物學功能，如細胞的增殖、凋亡、遷移等一系列過程，目前已知PI3K/AKT在細胞增殖、凋亡、遷移以及血管新生等相關過程中，起重要的作用［11-12］。RA發生后，機體的多種免疫細胞被激活，并產生大量的炎性細胞因子，炎癥因子與相應的細胞表面受體結合后，可分別激活不同的信號通路，將刺激信號傳到細胞核，從而調控細胞各種生物學功能的發生。

Gen作為受體酪氨酸激酶抑制劑，對多種癌細胞有抑制生長和刺激分化并誘導腫瘤細胞凋亡的作用［13-14］。同時Gen作為受體酪氨酸激酶抑制劑影響腫瘤細胞PI3K/AKT信號通路［15］。為進一步探討CIA大鼠關節FLS異常增殖及凋亡受阻的生物學機制及Gen對CIA大鼠關節FLS凋亡的影響機制，我們從細胞信號轉導通路水平進行了進一步的研究，發現造模后的CIA大鼠關節FLS p-AKT表達量明顯增高，結合凋亡蛋白Western blot結果，由此推斷，造模后CIA大鼠關節FLS在自分泌或旁分泌細胞因子的作用下，其PI3K/AKT信號轉導通路被異常活化，導致細胞凋亡受阻。Gen對CIA大鼠關節FLS PI3K/AKT信號轉導通路中AKT的表達無明顯影響，但Gen能夠降低AKT磷酸化形式p-AKT的表達量，從而調節其下游的生物學功能，如細胞的增殖、細胞的凋亡及細胞因子的產生。我們認為Gen能夠通過調節FLS信號轉導通路進一步調節凋亡蛋白表達。目前學術界理論認為，RA患者FLS存在PI3K/AKT信號轉導的異常活化，參與RA炎癥細胞的活化及異常增殖，同時，PI3K/AKT信號通路活化后具有明顯的抗細胞凋亡作用，而在RA患者滑膜組織中，FLS呈過度增殖并且表現凋亡受阻等腫瘤細胞增殖的特性，有實驗表明，PI3K的抑制劑wortmannin和LY294002能夠誘導細胞的凋亡，阻滯細胞周期在G1期，導致細胞生長停滯［16］，此結論與本研究結果相一致。

總之，AKT可能成為RA治療的一個新靶點，研究結果表明，抑制p-AKT的表達可能是Gen調節CIA大鼠FLS凋亡蛋白表達的原因之一，因此Gen可能是未來治療RA的有效措施之一。

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