酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)人血漿中纖維蛋白原含量

姜國(guó)亮

纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)為肝臟合成的一種重要的血漿糖蛋白，是由健康人血漿分離，經(jīng)提純凍干制成。可提高血中纖維蛋白原濃度，促進(jìn)血液凝固進(jìn)而止血，缺乏、消耗過(guò)多或纖維蛋白酶亢進(jìn)易導(dǎo)致凝血障礙。臨床多用于妊娠中毒、死胎、產(chǎn)后出血、胎盤(pán)早期剝離、大手術(shù)、嚴(yán)重大出血等所引起的纖維蛋白原缺乏導(dǎo)致的凝血障礙。血漿中纖維蛋白原檢測(cè)方法按原理可分為熱/鹽沉淀法，可凝固蛋白法和免疫法［1］。纖維蛋白原釋放纖維蛋白肽A(FPA)的能力可反映纖維蛋白原分子結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能完整性。本研究采用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA法測(cè)定FPA濃度，為檢測(cè)纖維蛋白原生物學(xué)活性唯一方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 (1)0.05 mol/L PH9.6碳酸鹽緩沖液包被液(2)0.01 mol/L PH7.4 PBS-Tween 20稀釋液(3)洗滌液，同稀釋液(4)10%BSA封閉液(5)TMB工作液(6)FPA(SIGMA)(7)羊抗人FPA抗體(8)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊抗體(9)Superblock溶液。

1.2 方法

1.2.1 原理 其原理是標(biāo)本與凝血酶作用釋放出FPA抗原，加入過(guò)量的FPA抗體(一抗)，F(xiàn)PA與部分抗體結(jié)合。將抗原抗體復(fù)合物加入包被有FPA的酶標(biāo)板，混合液中未被結(jié)合的第一抗體與酶標(biāo)板上的FPA結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的第二抗體，最后加酶底物顯色。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟 參考任躍明［2］等的方法進(jìn)行，略有改動(dòng)。稀釋至10μg/ml的FPA抗原包被96孔板，4℃過(guò)夜，包被體積100μL/孔。洗甩5次后，加10%200μL/孔 BSA 37℃封閉2 h。用10%的Superblock溶液將樣品稀釋10倍后，加入等體積的凝血酶混勻，37℃放置30 min。然后用10%Superblock溶液將復(fù)溶的 FPA 稀釋為2.5 ng/ml，10 ng/ml，40 ng/ml，80 ng/ml，160 ng/ml。然后取稀釋標(biāo)準(zhǔn)液、懸液、及 10%Superblock溶液各75μL，加入300μL用生理鹽水稀釋750倍的羊抗人FPA，37℃水浴1 h。加100μL/孔于酶標(biāo)板，37℃孵育1 h。洗甩5次后，加酶標(biāo)二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊抗體1∶5000)100μL/孔37℃孵育1 h。洗甩5次后，加底物TMB顯色5 min(100μL/孔)。最后每孔加50μLH2SO4終止反應(yīng)。492 nm酶標(biāo)儀下讀OD值。

1.3 結(jié)果判定 參考任躍明［2］等的方法進(jìn)行，略有改動(dòng)。將FPA含量、對(duì)INVA做雙對(duì)數(shù)直線回歸，求得回歸方程，計(jì)算樣品的FPA含量，r應(yīng)大于等于0.9 9。

2 結(jié)果

2.1 第二抗體稀釋倍數(shù)選擇 生理鹽水將第二抗體稀釋至500倍、1000倍、1300倍，用競(jìng)爭(zhēng)抑制性ELISA法測(cè)定，根據(jù)測(cè)得A值繪制曲線，結(jié)果顯示稀釋1000倍為適宜的第二抗體稀釋倍數(shù)。

2.2 凝血酶稀釋度選擇 40 mmol/LCaCl2稀釋凝血酶至2.5、5、10、20、40、80、100、150 IU/ml，ELISA 測(cè)定，根據(jù)測(cè)得 A值繪制曲線，結(jié)果表明10 IU/ml為最適宜凝血酶作用濃度。

2.3 反應(yīng)溫度、時(shí)間選擇 選擇FPA抗原-第一抗體混合液分別選擇作用45 min、1.5 h，選擇室溫，20℃、37℃三種不同溫度，ELISA棋盤(pán)法測(cè)定，同上繪制曲線，結(jié)果表明室溫1.5 h為較理想的作用條件。

2.4 人血漿中纖維蛋白原含量回收率分析 樣品稀釋液將FPA 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至 60 ng/ml，20 ng/ml，5 ng/ml，結(jié)果分別為64.3、19.6、5.5 ng/ml，回收率分別為 107.2% 、98% 、110% 。

3 討論

人纖維蛋白原為我國(guó)新近研制的產(chǎn)品，纖維蛋白肽A(FPA)的釋放直接反映凝血酶活性，對(duì)于血清中FP的監(jiān)測(cè)具有十分重要的意義。通常血漿中FP含量很低，如何建立靈敏度高、特異性好的檢測(cè)方法顯得尤為重要。臨床主要采用放射免疫分析法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)及高效液相層析法［3］。

ELISA法設(shè)備要求低，無(wú)輻射污染，樣品用量少，靈敏度高、特異性好，在臨床上應(yīng)該廣泛。本組試驗(yàn)在探索最佳實(shí)驗(yàn)條件后，用建立起來(lái)的競(jìng)爭(zhēng)抑制性ELISA法測(cè)定人血漿蛋白原中，纖維蛋白肽A的含量，回收率高，操作簡(jiǎn)單方便，值得推廣應(yīng)用。

［1］ 段櫻，劉樹(shù)業(yè).纖維蛋白原及其檢測(cè)進(jìn)展.哈爾濱醫(yī)藥，2008，28(1):50-53．

［2］ 任躍明，侯繼鋒.競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA法檢測(cè)FPA.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009，13(11):1605-1607．

［3］ 王德明，李曉紅，余蓉.纖維蛋白肽的研究進(jìn)展.中國(guó)輸血雜志，2005，18(4):348-350．