TRAIL聯合順鉑誘導骨肉瘤 HOS-8603細胞凋亡研究

周志剛 廖建平 傅江明 李強 嚴朝華 蔡亮

骨肉瘤是一種相對耐藥的腫瘤，單藥化療的效果一直不很理想。聯合化療多以鉑類藥物為主。TRAIL是INF超家族成員，能選擇性殺傷腫瘤細胞。本實驗旨在探討TRAIL與鉑類藥物聯合化療方案的可行性，為骨肉瘤的臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 HOS-8603細胞株購自中國醫學科學院藥物研究所;TRAIL、順鉑、CsA均購自Sigma公司(化學純標準品)。主要器材:流式細胞儀 型號:EPICS ALTRAⅡ.American Beckman;熒光酶標儀 型號:GENIOS VA200，AUSTRIA TECAN。

1.2 藥物配制 將TRAIL用生理鹽水溶解并分別配制成10ug/ml和50ug/ml兩種濃度的儲藏液。將順鉑、CsA分別用生理鹽配制成10ug/ml的儲藏液，備用。

1.3 凋亡細胞熒光染色 HOS-8603細胞以1×106接種于六孔板培養，加入不同濃度的TRAIL+順鉑，培養24 h后，經DHanks液洗滌及熒光染料Hoechst33258和PI，37℃避光染色10 min，洗滌后在熒光顯微鏡下觀察細胞形態及顏色改變。

1.4 透射電鏡觀察 1000 r/min，離心10 min收集處理后的HOS-8603細胞，經固定、脫水、包被及乙酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙染色處理后透射電鏡觀察細胞形態。

1.5 MTT法測定TRAIL，順鉑，TRAIL+順鉑對HOS-8603細胞生長的影響 取對數生長期HOS-8603細胞，以2×106/ml的細胞濃度，接種于上述三種藥物處理培養基中，以生理鹽水為空白對照組。將每種藥物組分兩組，其中一組在加藥物前30 min加入終濃度1.0 μg/mlCsA［10，11］，每組設 3 個平行對照孔。

1.6 細胞DNA含量分布測定 取藥物處理12，24，36，48 h后HOS-8603細胞，經固定、染色后流式細胞儀測定DNA。

1.7 細胞ΔΨm檢測 參照文獻［1，2］，取上述三種藥物處理12，24，36，48 h后的HOS-8603細胞，經DHanks液洗滌后用10ug/ml Rh123在37℃避光染色30 min，再次洗滌后用10ug/ml PI在37℃避光染色20 min，流式細胞儀檢測。

1.8 統計學方法 用SPSS統計軟件包作方差分析對各組作顯著性檢驗，TRAIL組與TRAIL加CsA組采用配對t檢驗，以P＜0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 HOS-8603細胞分別經2.5 ug/ml TRAIL，1.0 ug/ml順鉑，2.5μg/ml TRAIL+1.0μg/ml順鉑作用后，都出現了明顯的凋亡峰，亞G1期細胞百分率分別為29.3%，57%，83%。聯合用藥組明顯高于單一用藥組(P＜0.01)。

2.2 在熒光顯微鏡下，活細胞核呈彌散均勻熒光，出現凋亡時，細胞核或細胞質內可見濃染致密顆粒塊狀熒光。如圖1示。

圖1 比較兩圖中的同一細胞高藍/低紅為凋亡細胞;低藍/高紅為壞死細胞;低藍/低紅為正常細胞。

2.3 HOS-8603細胞經2.5ug/ml TRAIL+1.0 ug/ml順鉑作用12 h后，倒置顯微鏡下見細胞體積縮小，開始呈圓形，以細胞表面起泡，變成不規則形狀。緊鄰細胞之間出現空虛，有離群，脫落感。透射電鏡下見凋亡細胞核內染色質的濃縮，形成染色質塊，并集聚在核的邊緣，呈半月形，花瓣狀基底部緊貼核膜。胞質凝縮，最后核斷裂，細胞通過出芽的方式形成許多凋亡小體，其外有完整的膜封閉，其內有結構完整的細胞器，還有凝縮的染色體;線粒體腫脹，空泡狀，外膜破裂，內膜脹大呈氣球狀，脊消失。如圖3所示。

圖2 A 染色質濃縮，形成染色質塊，并邊聚在核的邊緣，呈半月形，花瓣狀，基底部緊貼核膜。

圖2 B 線粒體腫脹，空泡化，內膜腫大呈氣球狀，脊消失。胞質間可見早期凋亡小體。

2.4 經TRAIL+順鉑和TRAIL+順鉑+CsA處理后的細胞ΔΨm變化如表2所示;TRAIL+順鉑組的Rh123-PI-細胞百分率均明顯高于空白對照組(P＜0.01)。表明在胞膜完整的情況下，TRAIL+順鉑能引起ΔΨm下降(P＜0.01);TRAIL+順鉑作用前加入CsA后，Rh123-PI-細胞百分率明顯降低(P＜0.01)，但仍高于空白對照組(P＜0.01)。

2.5 TRAIL+順鉑作用于HOS-8603細胞后Rh123-PI-與亞G1期細胞百分率間有直線相關關系(r=0.998，P＜0.01)，即凋亡細胞百分率越高，ΔΨm下降細胞百分率越高。

3 討論

聯合化療是目前提高骨肉瘤細胞對化療的敏感性的研究熱點。本研究中TRAIL+順鉑的MTT法測定抑制率為58.5%。明顯優于兩者單用(P＜0.01)，說明在骨肉瘤化療中順鉑和TRAIL有協同作用，能增強骨肉瘤對化療的敏感性，并且順鉑的使用劑量明顯減少。

亞G1期細胞出現是細胞凋亡的標志之一。本研究中我們采用了TRAIL、順鉑，TRAIL+順鉑分別作用于HOS-8603細胞后測定亞G1期細胞百分率，結果顯示TRAIL+順鉑組誘導細胞凋亡的作用顯著高于TRAIL組和順鉑組(P＜0.01)。表明TRAIL+順鉑的聯合化療方案可能提高骨肉瘤細胞對化療的敏感性。

近年來研究證實，線粒體在細胞凋亡控制中起決定性作用［3，4］線粒體的早期改變為:線粒體膜通透性轉運孔(MPTP)開放，釋放線粒體內凋亡相關物質，這些物質激活Caspase-9酶系，從而引發連鎖反應而誘導細胞凋亡。MPTP是跨膜多蛋白孔，可能由電壓依賴的陰離子通道(VDAC)-腺苷酸移位酶-親環蛋白-D(CyP-D)三聯復合物構成［5-8］。在正常情況下MPTP只允許質子等分子量較小的物質通過線粒體膜，形成穩定ΔΨm。MPTP開放可導致ΔΨm下降或喪失，因此，可通過檢測ΔΨm觀察線粒體的改變［9-11］。本研究中我們發現經TRAIL和順鉑處理后的HOS-8603細胞ΔΨm隨藥物作用時間的增加而下降，并且與線粒體超微結構改變相一致。

順鉑和TRAIL聯合化療既增強骨肉瘤細胞對其化療的敏感性，又減少了順鉑的使用劑量。我們相信TRAIL和順鉑的聯合化療方案會有很廣闊的臨床應用前景。由于體外細胞株培養不能模仿體內三維結構，不能準確反映藥物-人體-腫瘤的復雜關系，且腫瘤具有一定的異質性。因此只能從實驗的角度來肯定聯合應用順鉑和TRAIL，能取得比單獨應用順鉑或TRAIL更明顯的對骨肉瘤細胞株的細胞毒性作用，為臨床應用提供了實驗依據，但進一步的結果尚需更深入的研究。

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