HPLC柱切換法比較輕度燒傷感染與中度燒傷感染患者頭孢吡肟的血藥濃度

段曉霞 鄭小林 張春玉

燒傷感染為常見(jiàn)的燒傷并發(fā)癥。國(guó)外學(xué)者研究表明燒傷感染患者由于其血漿蛋白水平的下降等生理原因，使其對(duì)藥物的處置程度也相應(yīng)發(fā)生變化，具體表現(xiàn)在藥物的腎小球?yàn)V過(guò)率增加［1］、藥物的代謝增加等，從而導(dǎo)致藥物的血藥濃度下降。為保證抗感染的效果，國(guó)外學(xué)者提出增加抗菌藥物的劑量或者縮短其給藥間隔期。頭孢吡肟為新一代的頭孢菌素類(lèi)抗菌素，抗菌活性高，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶尤其是染色體介導(dǎo)的Richmond-sykesⅠ型β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，對(duì)產(chǎn)Ⅰ型β-內(nèi)酰胺酶的革蘭陰性桿菌有很強(qiáng)的抗菌活性。本藥對(duì)產(chǎn)Ⅰ型β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、沙雷菌屬的抗菌活性超過(guò)頭孢他定等第三代頭孢菌素;對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌作用與頭孢他定相似或略差;對(duì)金黃色葡萄球菌等革蘭陽(yáng)性菌的抗菌活性也比第三代頭孢菌素有所增強(qiáng)［2］。由于燒傷患者的體液平衡變化程度與燒傷的輕重程度有關(guān)，故為合理化應(yīng)用抗菌藥物，研究不同燒傷程度的抗菌藥物濃度很有必要。有關(guān)輕度燒傷感染與中度燒傷感染患者頭孢吡肟的血藥濃度的比較，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道，為優(yōu)化燒傷感染患者的抗菌藥物給藥方案，本文采用HPLC柱切換法比較了輕度與中度燒傷感染患者頭孢吡肟的血藥濃度。

1 設(shè)備與試劑

1.1 設(shè)備 Waters高效液相色譜儀(美國(guó)密理博公司)、Waters2010系統(tǒng)工作站(美國(guó)密理博公司)、Waters 996光電二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)密理博公司)、Waters510雙泵(美國(guó)密理博公司)、700柱切換閥(美國(guó)Rheodyne);HL-1型恒流泵(上海醫(yī)療器械廠(chǎng));Rios超純水器(美國(guó)Millipore公司);分析柱Shim-pack C18(150 mm×4.6 mm);預(yù)柱(50 mm ×5 mm)，內(nèi)裝 μBondapak C18填料37～50μm，濕法裝柱;高速離心機(jī):上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.2 試劑 頭孢吡肟(對(duì)照品，廣州Sigma公司)、頭孢曲松(分析純，廣州Sigma公司)、乙腈(色譜純，天津四友試劑公司)、枸櫞酸鈉(分析純，廣州 Sigma公司)、二氯甲烷(分析純，廣州Sigma公司)、三氟乙酸(分析純，廣州Sigma公司)、雙蒸水(自制，電阻率18 mΩ)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品采集 樣品來(lái)源于15例輕度燒傷感染和11例中度燒傷感染男性患者，患者年齡(31±5)歲、體重(61±9)kg、體溫(38.6±0.5)℃，血清肌酐max＜104μmol/min。血清樣品均于靜脈滴注完患者2 g頭孢吡肟后的1，2，4，8和12 h采集并放置于-30℃的冰箱保存。

2.2 樣品處理 在2 ml的在血清樣品中加入1 mg/min-1頭孢曲松內(nèi)標(biāo)液50μl旋渦振蕩3 min后加入1 ml乙腈，再經(jīng)旋渦振蕩3 min后，以12000轉(zhuǎn)/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液加2 ml二氯甲烷后立即旋渦蕩5 min，再高速離心(12000轉(zhuǎn)/min)5 min，取上層水層進(jìn)樣25μl。

2.3 色譜條件 分析流動(dòng)相:乙腈-水(4.5∶9.5V/V)，加適量枸櫞酸鈉調(diào)pH至5.5;流速:1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):305 nm，靈敏度0.01AUFs，柱溫(30±0.1)℃;預(yù)處理流動(dòng)相:pH值2.6的磷酸溶液，流速:2.0 ml/min。

在該色譜條件下，樣品、內(nèi)標(biāo)分離良好，色譜圖譜如圖2、圖3。

2.4 柱切換分離測(cè)量流程

2.4.1 生物樣本預(yù)處理 柱切換系統(tǒng)分離預(yù)處理流程裝置見(jiàn)圖1中虛線(xiàn)。生物樣本注入預(yù)柱后，在預(yù)柱中進(jìn)行純化和富集，再經(jīng)預(yù)處理流動(dòng)相沖洗預(yù)柱。

圖1 柱切換系統(tǒng)分離測(cè)量流程裝置圖

2.4.2 生物樣本測(cè)量 柱切換系統(tǒng)分離預(yù)處理流程裝置見(jiàn)圖1中實(shí)線(xiàn)。待血漿中大部分雜質(zhì)沖洗后，高壓閥切換，使預(yù)柱和分析柱連接為串聯(lián)狀態(tài)，分析流動(dòng)相進(jìn)入預(yù)柱將保留在預(yù)柱中的氟尿苷沖洗入分析柱進(jìn)行分離測(cè)量。然后切換閥經(jīng)再次切回使分析柱和預(yù)柱的連接中斷，用預(yù)處理流動(dòng)相充分平衡預(yù)柱后，即可進(jìn)行下次進(jìn)樣。柱切換操作時(shí)間表見(jiàn)表1，血漿測(cè)量色譜見(jiàn)圖2，3。

圖2 空白血漿色譜圖

圖3 頭孢吡肟血漿色譜圖(A:頭孢吡肟，B:內(nèi)標(biāo))

表1 柱切換操作時(shí)間表

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的配制 將25 mg頭孢吡肟對(duì)照品溶于雙蒸水配制成2 mg/ml的原液，然后于容量瓶中稀釋為2000，1000，500，200，100，50，20，2.5 和 1 μg/ml的儲(chǔ)備液。隨后，將空白血漿加至上述儲(chǔ)備液中，配制為 200，100，50，20，10，5，2，1，0.5μg/ml的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將25 mg頭孢曲松對(duì)照品溶于雙蒸水配制成1 mg/ml內(nèi)標(biāo)溶液。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系 分別取標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品2 ml，按2.2項(xiàng)下處理，進(jìn)樣25μl，經(jīng)采集數(shù)據(jù)、建立頭孢吡肟光譜庫(kù)、優(yōu)化積分參數(shù)，按頭孢吡肟的濃度為橫坐標(biāo)、頭孢吡肟與頭孢曲松的峰面積比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在血漿中頭孢吡肟在0.5～200μg/ml的線(xiàn)性范圍內(nèi)得到線(xiàn)性關(guān)系良好的曲線(xiàn)方程:y=0.0347X+0.0059(r=0.9995)。

2.7 精密度試驗(yàn)及相對(duì)回收率試驗(yàn) 用空血漿配制頭孢吡肟0.5，10，200 μg/ml三個(gè)濃度的血樣，按“2.2”項(xiàng)下處理，進(jìn)樣，經(jīng)2010系統(tǒng)工作站，按內(nèi)標(biāo)峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法自動(dòng)求得樣品含量，計(jì)算相對(duì)回收率，結(jié)果頭孢吡肟濃度為0.5μg/ml的平均回收率(92.91±6.71)%，RSD:7.22%;10μg/ml的平均回收率(95.13±4.85)%，RSD=5.09%;200μg/ml的平均回收率(94.83±4.56)%，RSD=4.81%。

3 結(jié)果

3.1 日間差、日內(nèi)差 用空血漿配制頭孢吡肟0.5，10，200 μg/ml三個(gè)濃度的血樣，按“2.2”項(xiàng)下處理，進(jìn)樣，經(jīng)2010系統(tǒng)工作站，計(jì)算頭孢吡肟與頭孢曲松的峰面積比。日內(nèi)差(間隔1 h，n=5)與日間差(間隔24 h，n=6)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 日間差、日內(nèi)差

由表2可知日內(nèi)差、日間差的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均小于10%，表明實(shí)驗(yàn)方法相對(duì)穩(wěn)定。

3.2 輕度燒傷組和中度燒傷組的頭孢吡肟的血藥濃度 將輕度燒傷感染組和中度燒傷感染組的血漿樣品按2.2項(xiàng)下處理，進(jìn)樣，經(jīng)2010系統(tǒng)工作站，按內(nèi)標(biāo)峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法自動(dòng)求得樣品含量，頭孢吡肟的血藥濃度見(jiàn)表3。

表3 輕度燒傷組和中度燒傷組頭孢吡肟的血藥濃度

頭孢吡肟在輕度燒傷組和中度燒傷組的血藥濃度按成組比較，經(jīng)SPSS8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示:中度燒傷患者頭孢吡肟的代謝或消除大于輕度燒傷感染，故應(yīng)適當(dāng)縮短中度燒傷感染患者的頭孢吡肟的滴注的間隔時(shí)間或增大其用藥劑量。

4 討論

4.1 從表2結(jié)果可知，中度燒傷組的頭孢吡肟血藥濃度顯著低于輕度燒傷組(P＜0.05)，這可能與中度燒傷患者的藥物蛋白結(jié)合率有關(guān)［3］。

4.2 本文提示縮短中度燒傷感染患者的頭孢吡肟的滴注的間隔時(shí)間或增大其用藥劑量結(jié)論，主要是因?yàn)橹卸葻齻乃幯獫舛纫驘齻囊蛩卦黾恿怂幬锏拇x，故需了通過(guò)調(diào)整用藥劑量或增加用藥頻次的給藥方案提高該類(lèi)患者的血藥濃度。

4.3 本實(shí)驗(yàn)在測(cè)量樣品時(shí)采用了簡(jiǎn)易的離心生物樣品處理法，該步驟有賴(lài)于柱切換液相色譜法的特點(diǎn)，回避了單純HPLC法因蛋白質(zhì)與流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑發(fā)生反應(yīng)、導(dǎo)致沉淀，堵塞色譜柱，故不能直接進(jìn)樣的缺點(diǎn)［4］。

4.4 HPLC柱切換法的原理是:樣品中的蛋白質(zhì)及其他內(nèi)源雜質(zhì)受親水性外表面的作用和孔徑大小的限制，被預(yù)處理流動(dòng)相直接洗脫出來(lái)，而樣品中的被測(cè)物在洗脫至分析柱之前被吸附在填料間隙中，得以?xún)艋透患缓笄袚Q至并分析柱相連接，用分析流動(dòng)相將被測(cè)物從預(yù)柱洗脫出至分析柱，進(jìn)行分離測(cè)量。從而提高了分離和檢測(cè)效率。

［1］ Loirat P J，Rohan A.Baillet F，et al.Increased glomerular filtration rate in patients with major burns and itseffect on the pharmacokinetics of tobramycin N Engl JMed，1978，299:915-919．

［2］ Sanders，CC．Cefepime:the next generation?Clin Infect Dis，1993，17:369-379．

［3］ Martyn，J A J，D R Abernethy，D J Greenblatt．Plasma protein binding of drugs after severe burn injury.Clin.Pharmacol.Ther，1984，35:535-539．

［4］ 顧云.柱切換HPLC技術(shù)在生物樣品測(cè)定中的應(yīng)用.天津藥學(xué)，2003，15(2):80-82．