洋蔥皮總黃酮纖維素酶法提取及抗氧化研究

陳 佳，徐懷德,*，米林峰，包 蓉

洋蔥皮總黃酮纖維素酶法提取及抗氧化研究

陳 佳1，徐懷德1,*，米林峰2，包 蓉1

(1. 西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2. 榆林市產品質量監督檢驗所，陜西 榆林 719000)

采用中心組合試驗設計研究纖維素酶法輔助提取洋蔥皮中總黃酮的工藝條件，并對洋蔥皮總黃酮的抗氧化活性進行測定。結果表明：洋蔥皮總黃酮最佳提取工藝為纖維素酶用量0.52%、pH5.0、提取溫度48℃、提取時間105min、料水比(g/mL)1:40，在此條件下，提取率為2.32%。洋蔥皮總黃酮清除DPPH自由基和羥自由基的IC50分別為3.751、4.267μg/mL；同時洋蔥皮黃酮還原能力較強，高于茶多酚。洋蔥皮總黃酮抗氧化性強，是一種天然有效的抗氧化劑。

洋蔥皮；總黃酮；纖維素酶；提取；抗氧化活性

洋蔥(Allium cepa L.)為百合科蔥屬植物，世界洋蔥產量約4.4億噸，僅次于西紅柿，約占世界蔬菜總量的10%[1]。洋蔥皮中除含有豐富的蛋白質、色素、多糖外，還含有4.4%黃酮類物質[2]。洋蔥食用和加工過程中產生2%～3%洋蔥皮，數量相當可觀，如不加以利用，將造成資源的浪費和環境污染。

黃酮類化合物具有抗氧化、治療心腦血管疾病、抗癌、抗炎等作用[3-6]。洋蔥最外層表皮中槲皮素含量最高，同時黎乃維等[7]研究表明同一品種洋蔥中的黃酮含量從外鱗葉到內鱗葉依次降低。洋蔥總黃酮提取、黃酮含量測定及性質的初步鑒別已有文獻報道[8-11]，但酶法提取洋蔥皮中總黃酮的研究未見報道。與傳統提取方法相比，酶法提取具有無毒性、效率高、條件溫和等優勢[12]，本研究通過纖維素酶法輔助提取洋蔥皮總黃酮，探討洋蔥皮總黃酮的抗氧化性，為洋蔥皮總黃酮開發利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃皮洋蔥(山東海洋食品營養研究所)，取其外表皮，洗凈后于真空干燥箱中55℃烘干、粉碎、過40目篩，制成洋蔥皮粉備用。

蘆丁標品 中國藥品生物制品檢定所；纖維素酶(60000 U/g) 西安沃爾森生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

ALC-210.3型電子天平 德國賽多利斯公司；HHS6雙列六孔型電熱水浴鍋、FWl00型高速萬能粉碎機、KQ-B30型氣流烘干器 北京科偉有限公司； SHB-III循環水式多用真空泵 鄭州長城科貿有限公司；DHG-9070A型熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；PHS-3C型精密pH計 上海精密科學儀器有限公司；R-200型旋轉蒸發儀；UV-1700型紫外-可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 標準方程的建立

AlCl3顯色法[13]：精密稱取105℃條件干燥至質量恒定的蘆丁標品10mg，用50%乙醇溶解，搖勻，定容至100mL，得到0.1mg/mL蘆丁標準品溶液，作為貯備液備用。分別精密吸取上述蘆丁標準液0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL于25mL比色管中，加入1.5% AlCl38mL和醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.5) 4mL，并用50%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置0.5h。在波長415nm下測吸光度，以吸光度為縱坐標，以顯色液中蘆丁的質量(mg)為橫坐標，繪制標準曲線：A=31.77x ＋0.006，R2=0.9997。

1.3.2 洋蔥皮總黃酮的制備和含量測定

準確稱取1g洋蔥皮樣品，加入一定量的纖維素酶和醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，在不同條件下進行酶解反應。反應后將提取液煮沸5min，使酶滅活，過濾。將濾液真空濃縮至原液的1/3，定容至50mL，待測。

取各組不同試驗條件下所得的定容樣液1mL，按照標準曲線建立的方法，測出其吸光度，根據標準曲線，求出提取液中總黃酮的含量，并計算黃洋蔥皮中總黃酮提取率。

式中：A為吸光度；V1為樣品定容的體積；V2為待測樣液的體積；m為原料質量。

1.3.3 洋蔥皮總黃酮酶法提取的試驗設計

表1 洋蔥皮總黃酮酶法提取中心組合試驗因素水平表Table 1 Variables and their coded levels in CCD design

根據預試驗及單因素試驗結果，固定料水比為1:40，選取纖維素酶用量、提取時間、pH值和提取溫度作為中心組合試驗因素，中心組合試驗數據使用Design Expert 7.0軟件，見表1。

1.3.4 洋蔥皮總黃酮的抗氧化性研究

本實驗選清除DPPH自由基、·OH的能力以及還原力作為測定洋蔥皮總黃酮抗氧化能力的指標，同時以茶多酚為對照，比較同一質量濃度下抗氧化能力的強弱。

1.3.4.1 清除DPPH自由基的測定方法[14-15]

將洋蔥皮總黃酮粗提物稀釋成不同的質量濃度梯度，各取2mL不同質量濃度的黃酮溶液于試管中，再加入2mL 0.04mg/mL DPPH自由基溶液，混合均勻，反應20min，3500r/min離心10min，取上清液在波長517nm處測其吸光度(Ai)；另各取2mL不同質量濃度的黃酮溶液于試管中，分別加入無水乙醇2mL，反應20min，3500r/min離心10min，取上清液在波長517nm處測其吸光度(Aj)；以2mL 0.04mg/mL DPPH自由基溶液和2mL無水乙醇反應做為參比，其吸光度記為A0。計算黃酮對DPPH自由基的清除率(E)(DPPH自由基)。

1.3.4.2 清除·OH的測定方法[16]

將洋蔥皮總黃酮提取物用雙蒸水配制成不同質量濃度梯度，各取2mL不同質量濃度的黃酮溶液，依次加入2mL 6mmol/L FeSO4、2mL 6mmol/L H2O2，混勻后靜置10min，再加入2mL 6mmol/L水楊酸，混勻，靜置30min，在波長510nm處測其吸光度(Ai)，當用雙蒸水代替水楊酸時的吸光度(Aj)。空白對照組以雙蒸水代替黃酮溶液吸光度(A0)。計算黃酮對羥自由基的清除率(E)(·OH)。

1.3.4.3 總黃酮還原力的測定[17]

取2.5mL不同質量濃度總黃酮溶液，加入0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.6) 2.5mL及含1%鐵氰化鉀水溶液2.5mL，50℃水浴20min后急速冷卻，加入含10%三氯乙酸水溶液2.5mL，于3000r/min離心10min，取上清液5mL，加蒸餾水4mL及含0.1%三氯化鐵水溶液1mL，混勻后10min于波長700nm處測定吸光度。吸光度越大，則說明還原能力越強。

2 結果與分析

2.1 中心組合試驗設計結果分析

表2 洋蔥皮總黃酮提取中心組合試驗設計與結果Table 2 CCD arrangement and corresponding experimental results

中心組合試驗結果見表2，采用Design Expert軟件對表2試驗數據進行回歸分析，得到洋蔥皮總黃酮提取率對編碼因素二次多項回歸方程：

由表3可知，P模型＜0.0001，試驗所選用的二次多項模型極顯著，失擬項不顯著(P= 0.0547＞0.05)，其校正調整決定系數R2=0.8885，該模型能解釋88.85%響應值的變化，因此該模型擬合程度較好，可以用此模型對酶法提取洋蔥皮總黃酮進行分析和預測。

表4方程回歸系數顯著性檢驗表明：模型一次項X3(P＜0.01)差異高度顯著；二次項X12、X22、X32和X42(P＜0.0001)差異極顯著，一次項X1、X4(P＜0.05)差異顯著，交互項X2X3、X3X4(P＜0.05)差異顯著。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variances for total flavonoid yield with various extraction conditions

表4 回歸方程模型系數顯著性分析Table 4 Variance analysis of fitted regression equation predicting total flavonoids yield

2.2 主因素效應分析

在纖維素酶輔助提取情況下，提取溫度對洋蔥皮總黃酮提取率影響最大，其次是加酶量和提取時間，然后是pH值。

2.3 交互因素效應分析

將方程(5)中的任意兩個因素固定在零水平，對余下的兩個因素按照所得的二元二次回歸方程進行Design Expert軟件編程運算，結果表明交互項X2X3、X3X4作用顯著，其響應面及等高線如圖1～2所示，2組圖直觀地反映了各因素對響應值的影響。

圖1 pH值(X2)與提取溫度(X3)對總黃酮提取率的影響Fig.1 Response surface plot showing the effects of pH value and extraction temperature on total flavonoids yield

從圖1可得出：總黃酮提取率隨著pH值的增大先增后減，在pH5.0左右能獲得較高的提取率；總黃酮提取率隨著提取溫度的增大先增后減，在提取溫度50℃左總黃酮的提取率最高。由圖1可以確定最佳水平范圍即pH4.8～5.0，提取溫度為45～50℃。

在pH值的不同水平下，隨著提取溫度的升高，總黃酮提取率改變的變異度不同；在提取溫度的不同水平下，隨著pH值的增加，總黃酮提取率改變的變異度亦不同。

圖2 提取溫度(X3)與提取時間(X4)對總黃酮提取率的影響Fig.2 Response surface plot showing the effects of extraction temperature and time on total flavonoids yield

通過圖2可得出：總黃酮提取率隨著提取溫度的增大先增后減，在提取溫度50℃左右總黃酮的提取率最高。總黃酮提取率隨著加酶量的增大先增后減，在加酶量為0.5%左右可以得到較高的提取率。

2.4 最佳提取條件的確定

通過響應面回歸方程經Design-Expert 7.0軟件分析，得出洋蔥總黃酮最佳提取工藝為加酶量0.524%、pH4.96、提取溫度48.1℃、提取時間105min、料水比1:40，其提取率預測可達到2.26%。實際中驗證以加酶量0.52%、pH5.0、提取溫度48℃、提取時間105min為提取參數，得到洋蔥皮總黃酮提取率為2.32%(n=3)，與理論預測值相比相對誤差＜3%，因此，采用響應面優化得到的提取工藝參數準確可靠。

2.5 洋蔥皮總黃酮的抗氧化性分析

2.5.1 洋蔥皮總黃酮對DPPH自由基清除效果

圖3 洋蔥皮總黃酮質量濃度對DPPH自由基清除率影響曲線Fig.3 Concentration dependent DPPH radical scavenging effect of onion peel flavonoids

從圖3可以看出：在1～10μg/mL 范圍內，洋蔥皮總黃酮對清除DPPH自由基有較好的量效關系。在1～10μg/mL范圍內，隨著洋蔥皮總黃酮質量濃度的增加，其清除DPPH自由基的能力逐步增強。經過數據模擬曲線的方程得到：洋蔥皮總黃酮清除DPPH自由基的IC50為3.751μg/mL，而茶多酚的IC50為2.976μg/mL，洋蔥皮總黃酮的IC50約是茶多酚的1.3倍。因此，雖然洋蔥皮總黃酮清除DPPH自由基效果稍差于茶多酚，但是洋蔥皮總黃酮仍然表現出很強的清除DPPH自由基的能力。

2.5.2 洋蔥皮總黃酮對·OH清除效果

圖4 洋蔥皮總黃酮質量濃度對·OH清除率影響曲線Fig.4 Concentration dependent hydroxyl radical scavenging effect of onion peel flavonoids

由圖4可看出：10～100μg/mL范圍內隨著洋蔥皮總黃酮質量濃度的增加其清除·OH的能力增強。在10～40μg/mL范圍內，洋蔥皮總黃酮對·OH的清除效果稍高于茶多酚。但隨著質量濃度的增大，洋蔥皮總黃酮的清除率顯著高于茶多酚。經過數據模擬曲線的方程得到：洋蔥皮總黃酮清除·OH的IC50為4.267μg/mL，而茶多酚清除·OH的IC50為1.350μg/mL，洋蔥皮總黃酮的IC50約是茶多酚的3.2倍。

2.5.3 洋蔥皮總黃酮還原力的測定

圖5 洋蔥皮總黃酮的還原力Fig.5 Concentration dependent reducing power of onion peel flavonoids

由圖5可看出，洋蔥皮總黃酮和茶多酚隨質量濃度的增大其吸光度逐漸增加，洋蔥皮總黃酮的增大趨勢大于茶多酚，由此可見洋蔥皮總黃酮的還原力極強。經SAS分析，洋蔥皮總黃酮的還原力與質量濃度呈直線相關，其回歸方程為：y= 0.0181x＋0.1085，R2=0.9981；茶多酚的還原力也與質量濃度呈直線關系，其回歸方程為：y= 0.0148x＋0.1388，R2=0.9967。因此，洋蔥皮總黃酮還原力強于茶多酚。

3 結 論

3.1 采用中心組合設計試驗和響應面分析分別研究纖維素酶用量、pH值、提取溫度、提取時間4因素對洋蔥皮總黃酮提取率的影響。洋蔥皮總黃酮提取率的回歸方程為：Y1=2.210-0.078X1-0.039X2-0.110X3-0.095X4＋0.043X1X2-0.017X1X3＋0.002X1X4-0.110X2X3＋0.042X2X4＋0.089X3X4-0.099X12-0.210X22-0.180X32-0.130X42。

3.2 洋蔥皮總黃酮酶法提取最佳工藝為纖維素酶用量0.52%、pH5.0、提取溫度48℃、提取時間105min、料水比(g/mL)1:40，此條件下洋蔥皮黃酮的提取率可達到2.32%。3.3洋蔥皮總黃酮具有較強的清除DPPH自由基和·OH的能力，其IC50分別為3.751、4.267μg/mL，且洋蔥皮總黃酮對DPPH自由基的抑制能力大于·OH；同時洋蔥皮黃酮還原能力較強，高于茶多酚。說明洋蔥皮黃酮具有良好的抗氧化作用，是一種天然有效的抗氧化劑。

[1]GRIFFITHS G, TRUEMAN L, CROWTHER T, et al. Onions a global benefit to health[J]. Phytotherapy Research, 2002, 16(7): 603-615.

[2]白明生, 陳彥云, 李國旗. 洋蔥皮總黃酮的超聲波提取工藝研究[J].食品科技, 2008, 33(12): 190-193.

[3]YAO Lihu, JIANG Yueming, SHI J, et a1. Flavonoids in food and their health benefits[J]. Plant Foods for Human Nutrition, 2004, 59(3): 113-122.

[4]蔡為榮, 顧小紅, 湯堅. 仙人掌皮黃酮提取工藝優化[J]. 農業工程學報, 2008, 24 (6): 299-303.

[5]WOLFRAM S. Effects of green tea and EGCG on cardiovascular and metabolic health[J]. Am Coil Nutr, 2007, 26(4):373-388.

[6]KOOK S H, SON Y O, JANG Y S, et al. Inhibition of c-Jun Nterminal kinase sensitizes tumor cells to flavonoid. Induced-apoptosis through down-regulation of Jun[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2008, 227(3): 468-476.

[7]黎乃維, 趙玉平, 楊建榮, 等. 水浸提法提取洋蔥黃酮類化合物的工藝條件研究[J]. 食品科技, 2007(3): 110-113.

[8]王瑩, 王澤南, 王婷. 洋蔥皮黃酮類物質提取工藝的研究[J]. 食品研究與開發, 2006, 27(11): 87-89.

[9]侯冬巖, 回瑞華, 劉曉媛, 等. 洋蔥皮中黃酮化合物的超聲提取與光譜分析[J]. 食品科學, 2006, 27(9): 172-174.

[10]高岐, 劉宏文. 洋蔥中總黃酮的微波提取法[J]. 食品工業科技, 2008, 29(1): 218-219.

[11]SOTOFT M, CHRISTENSEN J H, NIELSEN J, et al. Pressured liquid extraction of flavonoids in onions. method development and validation [J]. Talanta, 2009, 80(1): 269-278.

[12]蘇東林, 單楊, 李高陽, 等. 酶法輔助提取柑桔皮總黃酮的工藝優化研究[J]. 農業工程學報, 2008, 24(4): 240-245.

[13]何書美, 劉敬蘭. 茶葉中總黃酮含量測定方法的研究[J]. 分析化學研究簡報, 2007, 35(9): 1365-1368.

[14]AMAROWICZ R, NACZK M, SHAHIDI F. Antioxidant activity of various fractions of non-tanin phenolics of canola hulls[J]. Jagnc Food Chem, 2000, 48(7): 2755-2759.

[15]李艷伏, 徐懷德, 陳金海. 木瓜蛋白酶酶解核桃粕蛋白產物抗氧化活性研究[J]. 中國食品學報, 2008, 8(5): 8-13.

[16]吳瓊英, 賈俊強. 柚皮黃酮的超聲輔助提取及其抗氧化性研究[J]. 食品科學, 2009, 30(2): 29-33.

[17]莫開菊, 柳圣, 程超. 生姜黃酮的抗氧化活性研究[J]. 食品科學, 2006, 27(9): 110-114.

Enzymatic Extraction and Antioxidant Activity of Onion Peel Flavonoids

CHEN Jia1，XU Huai-de1,*，MI Lin-feng2，BAO Rong1
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；2. Supervision and Examination Station of Product Quality of Yulin City, Yulin 719000, China)

The central composite design (CCD) method was employed to study the cellulase-assisted extraction process of total flavonoids from onion peel, and their antioxidant activities were also evaluated. The results showed that the optimum extraction conditions were obtained as follows: cellulose added at a ratio of 0.52% to hydrolyze onion peel suspended in a 40-fold volume of water adjusted to pH 5.0 for 105 min. The extraction rate of flavonoids under these extraction conditions was 2.32%. Moreover, antioxidation experiments showed that flavoniods from onion peel had very strong scavenging effects on DPPH free and hydroxyl radicasl, and the corresponding IC50values were 3.751μg/mL and 4.267μg/mL. Meanwhile, onion peel flavonoid showed stronger reducing power when compared to tea polyphenols. These findings suggest that onion peel flavonoids are a group of strong antioxidants and have promising application prospects in healthcare foods and drugs.

onion peel；total flavonoids；cellulase；extraction；antioxidant activity

TS255

A

1002-6630(2011)04-0037-05

2010-03-25

陳佳(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為天然產物提取分離。E-mail：chenjia198684@126.com

*通信作者：徐懷德(1964—)，男，副教授，研究方向為軟飲料、果品蔬菜貯藏與加工、天然產物提取。E-mail：xuhuaide@yahoo.com.cn