昆明系小鼠生物法定量測定水產品中河豚毒素

王 靜，楊麗君*，李兆杰**，趙 萌，宋曉華，劉玉敏

昆明系小鼠生物法定量測定水產品中河豚毒素

王 靜，楊麗君*，李兆杰**，趙 萌，宋曉華，劉玉敏

(威海出入境檢驗檢疫局，山東 威海 264205)

為建立昆明系小鼠定量測定河豚毒素(TTX)方法，選用體質量19～21g的昆明系小鼠作為實驗對象，用不同質量濃度TTX溶液腹腔注射小鼠。結果顯示：TTX致昆明系小鼠的半數致死量(LD50)為0.18μg，小鼠死亡時間與TTX注射劑量滿足方程Y=e(0.357/X＋1.005)。此外，采用體積分數0.5%乙酸溶液提取TTX，回收率達到90%以上，對樣品的最低檢測限為0.56μg/g。昆明系小鼠定量測定河豚毒素，準確、穩定、方便快捷，可用于水產品安全檢測。

河豚毒素；半數致死劑量(LD50)；昆明系小鼠；提取

河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是普遍存在于河豚魚及其他生物體內的一種生物堿，它是自然界中毒性最強的非蛋白類神經毒素之一[1]。河豚魚味道鮮美，營養豐富，日本、中國等亞洲國家的居民素有食用的習慣，但因TTX化學性質相當穩定，日曬、鹽腌及一般烹飪手段均難以破壞，中毒后也缺乏有效的解救措施，故TTX中毒事件屢有發生，嚴重威脅人們的生命安全。

為了控制TTX中毒事件的發生，各國有關部門均采取了嚴格的管理措施，我國《水產品衛生管理法》雖然嚴格規定了河豚魚的銷售，但TTX中毒的現象時有發生。因此提高食用河豚魚質量安全水平，不僅要加強安全監管，更重要的是不斷完善基層的快速、定量檢測TTX的方法。

目前，對TTX的檢測方法有多種，如小鼠生物檢測法、薄層色譜法、電泳法、酶聯免疫法、柱后衍生液相色譜熒光檢測法、氣相色譜-質譜聯用法、固相萃取-超過濾-液相色譜/質譜連用法、LC-MS聯用法等[2-6]。色譜法及免疫法等方法雖然檢測精度高，但操作繁瑣，儀器價格昂貴，耗費大，一般多用于科研方面研究應用，不適于生產一線及流通過程中的快速檢測。小鼠生物法是日本官方檢測TTX的生物學方法[7-8]，具有直觀、快速、癥狀典型、易于操作、費用低，而檢測精度能滿足水產品安全監測要求等特點，也被國際上廣泛采用。

小鼠生物法的基本原理是TTX注射劑量與小鼠死亡時間倒數存在確定關系[9]，因此，可根據小鼠死亡時間來推斷體內TTX含量。目前小鼠生物法國際上大都采用ddy系小白鼠，臺灣學者試用ICR小鼠替代ddy小鼠，收到良好效果[10]。但目前國內尚無ddy系小鼠飼養點，ICR小鼠飼養點極少，本研究選用常見的昆明系小鼠(19～21g)作為試驗動物，進行TTX定量檢測方法研究，建立從提取到檢測、系統的昆明系小鼠定量測定TTX方法，為水產品生產企業及檢驗機構快速準確的檢測TTX，控制水產品質量安全，提供一定的參考依據依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河豚肌肉組織取自威海某公司養殖東方紅鰭豚，養殖環境受控，為無河豚毒素河豚；體質量為19～21g的雄性昆明系小鼠購自煙臺綠葉制藥有限公司實驗動物中心，飼養參照GB 14925—2001《實驗動物環境及設施》進行。

TTX標準品(純度≥99%) 昆明科翔生物科技有限公司，于4℃保存。

TTX標準溶液：向1mg TTX干粉標準品中加入10mL體積分數為 0.1%的乙酸，溶解混勻，配制成100μg/mL母液。用微量移液器吸取100μg/mL母液1mL于100mL容量瓶中，加入0.1%乙酸溶液定容至100mL，即得到1.0μg/mL的標準溶液。以此標準溶液和0.1%乙酸溶液配制0.65～0.25μg/mL的梯度溶液，相鄰質量濃度差為0.05μg/mL。

1.2 儀器與設備

CR22GⅢ離心機 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠有效死亡的判定

用1mL注射器(配5號針頭)，分別抽取1mL不同質量濃度的TTX溶液，對小鼠進行腹腔注射。當TTX溶液完全注入小鼠腹腔時開始計時，如果注射時有1滴以上TTX溶液從小鼠腹內溢出，則判定小鼠死亡時間無效。

小鼠TTX中毒的典型癥狀為初期呼吸困難，急促，腹部收縮加快，反應遲鈍，繼而出現突然疾走，急跑急跳，四處亂竄，東倒西歪，翻轉亂跳等掙扎動作，數十秒后，小鼠后腿劇烈抽搐，2～3次后爬臥不動，腹部呼吸逐漸微弱減慢，最后死亡。以停止呼吸作為判斷死亡的標準。

1.3.2 TTX對昆明系小鼠半數致死量(LD50)的測定

將19～21g的昆明系小鼠隨機分為4組，每組10只，配制TTX質量濃度為0.15、0.171、0.195、0.221μg/mL。給每組小鼠腹腔注射不同質量濃度的TTX溶液，每只注射1mL，記錄小鼠死亡數量，用Bliss法，利用計算機BL-410程序計算得出TTX對昆明系小鼠的半數致死量(LD50)。

1.3.3 TTX劑量與小鼠死亡時間的關系

隨機將昆明系小鼠分成9組，每組10只，體質量在19～21g。每組分別腹腔注射TTX質量濃度為0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65 μg/mL，每鼠注射1mL。記錄每組小鼠的死亡時間，采用Microsoft Excel 2003軟件，以TTX注射劑量為x軸，小鼠死亡時間為y軸，將有效數據作散點圖。根據散點圖，采用SPSS 11.0軟件，將TTX注射劑量(X)和小鼠死亡時間(Y)采用曲線估計法中的S模型得出兩者之間的經驗方程。

1.3.4 經驗方程的驗證

取0.4μg/mL與0.6μg/mL兩種不同質量濃度的TTX溶液，用相同方法腹腔注射小鼠，每個濃度注射15只小鼠并獲得10個有效數據，取其平均值，將所得平均值分別代入經驗方程，推算注射劑量；再根據劑量計算出TTX質量濃度，與0.4μg/mL和0.6μg/mL兩個標準質量濃度相比，計算測定誤差。

1.3.5 TTX提取方法回收率的測定

取不含TTX的河豚肌肉組織，勻漿器勻漿，稱取10g于50mL離心管中，加入100μg/mL TTX 125μL(即12.5μg TTX)，攪拌混勻，使TTX充分吸附。然后加入0.5%乙酸溶液11mL，充分混勻，沸水浴中煮沸10min，期間加以攪拌防止組織結塊，沸后冷卻至室溫，20000×g離心20min，移取上清液于一干凈50mL離心管中，另向沉淀中加入0.5%乙酸溶液11mL，充分混勻，沸水浴中煮沸5min，沸后冷卻至室溫，20000 ×g離心20min，取上清液，將兩次離心上清液合并混勻，用0.5%乙酸定容至25mL。將此提取液腹腔注射小鼠，共注射10只，每只注射1mL，記錄小鼠死亡時間，根據TTX劑量-小鼠死亡時間關系曲線及經驗方程，計算提取液中TTX含量，與加入TTX標準品劑量相比，求出此提取方法的回收率。

1.3.6 昆明系小鼠測定TTX的最低檢測限

取不含TTX的河豚肌肉組織，勻漿器勻漿，分別稱取10g于4個不同的50mL離心管中，向其中各加入100μg/mL TTX 50、55.6、69.4、83.3μL，攪拌混勻，使TTX充分吸附。然后提取各個樣品中的TTX，方法同上，最后將各提取液用0.5%乙酸分別定容至25mL。將此提取液腹腔注射小鼠，每個提取液注射10只，每只注射1mL，同時注射0.18、0.20、0.25、0.30μg/mL的標準TTX溶液作對照。同時以提取液作為空白對照注射10只小白鼠。記錄每組小鼠死亡只數和死亡時間，據此判斷昆明系小鼠測定TTX的最低檢測限。

1.3.7 數據處理

采用SPSS 11.0軟件。

2 結果與分析

2.1 TTX對昆明系小鼠半數致死量(LD50)的測定

通過對體質量19～21g的昆明系小鼠注射不同劑量的TTX，應用Bliss法測得TTX對昆明系小鼠半數致死量LD50及95%的可信限分別為0.18μg和0.171～0.190 μg/mL(表1)。

表1 TTX對昆明小鼠半數致死量的測定Table 1 LD50determination of TTX for Kunming strain mice

2.2 TTX劑量與小鼠死亡時間的關系

以注射劑量為自變量(X)，小鼠死亡時間為因變量(Y)，得出注射劑量與小鼠死亡時間呈自然指數關系(圖1)，符合曲線Y=e(0.357/X＋1.005)，R2=0.992。

圖1 TTX劑量-昆明系小鼠死亡時間關系曲線Fig.1 Curves of TTX dosage against mean death time of Kunming mice

2.3 方法驗證結果

根據2.2節中注射劑量與小鼠死亡時間的自然指數關系方程，得出擬合曲線表達式：

式中：X為TTX注射劑量/μg；Y為昆明系小鼠死亡時間/min。

將昆明系小鼠的死亡時間代入曲線方程，從而計算得到TTX劑量，即得TTX質量濃度。各取10個有效數據的平均數，分別為6.75min和4.95min，代入曲線方程，得出TTX質量濃度分別為0.394μg/mL和0.601μg/mL，取兩位有效數字，即為0.39μg/mL和0.60μg/mL，與加入標準品質量濃度極為接近，符合性極好。

2.4 TTX提取方法回收率的測定

應用0.5%乙酸溶液煮沸并高速離心法提取TTX，可以使TTX的回收率大大提高，達到(90.4±3.7)%。實驗結果見表2。

表2 TTX回收率實驗結果Table 2 Recovery rates for TTX

2.5 昆明系小鼠測定TTX的最低檢測限

向無毒河豚肌肉組織中添加不同劑量的TTX，使肌肉組織TTX含量分別為0.50、0.56、0.69、0.83μg/g。考慮90%左右的提取方法回收率，初步估計對應TTX提取液的質量濃度分別約為0.18、0.20、0.25、0.30μg/mL。根據實驗觀測，注射提取液空白對照的10只小鼠均未死亡，注射0.18μg/mL TTX提取液，小鼠僅有部分死亡(6只)，而注射0.20、0.25、0.30μg/mL TTX提取液，小鼠全部死亡，且死亡時間與注射等質量濃度標準品相當。表明0.20μg TTX為昆明系小鼠的最低檢測量，與此相對應，此法對樣品的最低檢測限為0.56μg/g。

3 討 論

3.1 TTX對昆明系小鼠的LD50的分析

在實際毒素檢測過程中，通常用鼠單位的方法表示毒素的濃度。根據鼠單位(MU)的定義，1MU指采用腹腔注射的方式，30min內殺死1只20g體質量的雄性ddy小鼠的毒素量[7,10]，目前國際通用的鼠單位為日本學者測定的ddy系小鼠(1鼠單位=0.22μg TTX)。但因敏感性的不同，不同品系1MU所表示的TTX含量不同。Huang[10]以LD50作為1MU。TTX對臺灣ICR小鼠的LD50為0.178μg，對日本ddy小鼠的LD50為0.22μg，張理等[11]研究得出TTX對北京ICR小鼠的LD50為0.159μg，對昆明系小鼠的LD50為0.165μg，華元渝等[12]研究得出TTX對ICR小鼠的LD50為0.1836μg，由此可見即使是同一品系小鼠，LD50也有差異，究其原因，可能存在異地實驗或是TTX純度不同等某些影響因素。而本實驗得出TTX對昆明系小鼠的LD50為0.18μgTTX，較張理等[11]得出的LD50(0.165μg)稍高。

3.2 TTX注射劑量與昆明系小鼠死亡時間的曲線關系

許多研究表明，TTX注射劑量與小鼠死亡時間之間存在明顯的曲線關系[9,12-14]。根據此規律國內有諸多采用ICR系或昆明系小鼠進行TTX檢測方法的研究，但尚存在很多問題，如應用其他品系小鼠檢測TTX，但卻等同采用ddy系小鼠死亡時間與小鼠單位(MU)換算表，因不同品系對TTX的敏感性不同，故等同采用可能會產生較大誤差；或是根據在一定注射劑量范圍內TTX劑量與小鼠死亡時間倒數存在直線關系這一規律，由小鼠死亡時間推算TTX質量濃度，但這僅僅局限于TTX在一定劑量范圍內，超出或低于此劑量便不適用。本實驗得出了TTX注射劑量與昆明系小鼠死亡時間的自然指數關系，符合經驗方程Y=e(0.357/X+1.005)，且方法驗證結果表明，采用此公式計算TTX質量濃度，誤差很小，符合性非常好，此公式真正揭示了TTX致昆明系小鼠的死亡規律，對應用昆明系小鼠定量測定TTX更具有指導意義。

3.3 河豚毒素提取方法的改進

采用0.5%乙酸煮沸高速離心提取方法進行TTX的回收測定。結果顯示用此法提取TTX，回收率可達(90.4± 3.7)%，這較其他文獻報道的如0.1%乙酸提取法[7]，乙酸酸化甲醇提取法[15]等都高，分析其原因，可能有以下幾點：一是高濃度的乙酸可能有助于TTX的溶出；二是兩次煮沸使TTX溶出更完全；三是高速離心使TTX損失更少。另外，離心法取代了傳統的過濾法，可以大大加快樣品的制備速度。傳統的過濾法需要用較多的乙酸反復沖洗，易導致提取液體積的增加，擴大樣品的稀釋倍數，對于低毒組織的毒力測定非常不利。筆者通過實驗驗證還發現，應用乙酸酸化的甲醇法提取，存在一個嚴重問題：甲醇和乙酸會發生反應產生乙酸甲酯，而乙酸甲酯是一種有毒物質，會干擾結果的準確性。因此，應用0.5%乙酸煮沸高速離心的方法提取河豚毒素，更準確、更快速、更有效，為水產品生產企業及檢測機構嚴格控制水產品安全提供了可靠的方法指導。

3.4 昆明系小鼠測定TTX的最低檢測限

本實驗采用方法對TTX的最低檢測量0.20μg TTX，對樣品的最低檢測限為0.56μg/g。日本官方規定TTX含量小于10MU(ddy小鼠10個單位，相當于2.2μg/g)即可視為對人無毒，可以安全食用。2.2μg/g比本實驗的毒素最低檢測限0.56μg/g大了近4倍，反映出改進后的小鼠生物法的安全性和可靠性。

[1]WU Zhenlong, YANG Ying, XIE Liping, et al. Toxicity and distribution of tetrodotoxin-producing bacteria in puffer fish Fugu rubripes collected from the Bohai Sea of China[J]. Toxicon, 2005, 46(4): 471-476.

[2]王鍵偉. 河豚毒素的定量檢測方法研究進展[J]. 國外醫學: 衛生學分冊, 1995, 22(2): 86-89.

[3]李秋芬, 徐懷恕. 河豚毒素(TTX)及其微生物起源[J]. 海洋通報，1994, 13(4): 86-91.

[4]李曉川, 林美嬌. 河豚魚及其加工利用[M]. 北京: 中國農業出版社, 1998: 112.

[5]駱和東, 賈寶珠, 朱寶平. 固相萃取-超過濾-液相色譜/質譜聯用法測定織紋螺中的河豚毒素[J]. 色譜, 2007, 25(6): 917-921.

[6]李世平, 焦新安, 黃金林, 等. 河豚毒素兩種定量檢測方法的比較研究[J]. 揚州大學學報, 2004, 25(2): 58-60.

[7]厚生省生活衛生局監修. 食品衛生檢查指針: 理化學編[M]. 東京: 日本食品衛生協會, 1991: 296-299.

[8]食品衛生協會(日). 食品衛生檢驗手冊-理化檢驗手冊[M]. 天津: 天津科技翻譯出版社公司, 1993: 240-243.

[9]王亞麗, 王玉霞. 河豚毒素定量檢測的研究進展[J]. 軍事醫學科學院院刊, 2002, 26(2): 151-153.

[10]HUANG Dongfang. Bioassay of tetrodotoxix using ICR mouse strain [J]. J Chin Biochem Soc, 1991, 20(2): 80-86.

[11]張理, 謝克勤, 趙金山, 等. 用昆明小鼠定量測試河豚毒素的研究[J].中國食品衛生雜志, 2004, 16(6): 497-500.

[12]華元渝, 顧志峰, 丁正峰, 等. 小鼠生物法快速定量檢測河豚毒素[J].淡水漁業, 2004, 34(3): 22-25.

[13]JEN H C, LIN S J, LIN S Y, et al. Occurrence of tetrodotoxin and paralytic shellfish poisons in a gastropod implicated in food poisoning in southern Taiwan[J]. Food Additives & Contaminants: Part A, 2007, 24(8): 902-909.

[14]BEANI L, BIANCHI B, BUERRINI F, et al. High sensitivity bioassay of paralytic (PSP) and amnesic (ASP) algal toxins based on the fluorimetric detection of [Ca2+] in rat cortical primary cultures[J]. Toxicon, 2000, 38(9): 1283- 1297.

[15]林文鑾, 黃惠莉, 陳少欣, 等. 河豚毒素的提取研究[J]. 華僑大學學報: 自然科學版, 1999, 20(4): 412-414.

Quantitative Detection of Tetrodotoxin Using Kunming Strain Mice

WANG Jing，YANG Li-jun*，LI Zhao-jie**，ZHAO Meng，SONG Xiao-hua，LIU Yu-min
(Weihai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Weihai 264205, China)

This study was aimed at establishing a laboratory method for the quantitative detection of tetrodotoxin (TTX). A bioassay was developed by injecting intraperitoneally TTX at various dosages to Kunming strain male mice with body weights of 19-21 g. Results indicated that the 50% lethal dose (LD50) of TTX for Kunming strain mice was 0.18μg. The relationship between TTX dosage and the mean death time of Kunming mice could be expressed as Y = e(0.357/X+1.005). In addition, a high recovery rate of TTX was achieved by using 0.5% (V/V) acetic acid to extract TTX from globefish, which reached up to 90%. However, the detection limit of the assay for samples was 0.56μg/g. Therefore, Kunming strain mice can be used to quantitatively determine TTX in an accurate, stable and convenient manner, which is promising in the safety control of fishery products.

tetrodotoxin；50% lethal dose (LD50)；Kunming strain mouse；extraction

R155.5；TS254.1

A

1002-6630(2011)04-0181-04

2010-04-14

2009年國家質量監督檢驗檢疫總局出入境檢驗檢疫行業標準制(修)訂計劃項目(2009B138)

王靜(1975—)，女，工程師，學士，主要從事微生物學和海洋毒素研究。E-mail：wangjing7548@sohu.com

*并列第一作者：楊麗君(1969—)，女，工程師，學士，主要從事微生物學和海洋毒素研究。E-mail：whylj2000@yahoo.com.cn

**通信作者：李兆杰(1981—)，男，工程師，博士，主要從事海洋生物學、微生物學及海洋生物技術研究。

E-mail：hunterlee_81@163.com