用于食源性疾病病原菌診斷的基因芯片研究及評價

任莉莉，從彥麗*

用于食源性疾病病原菌診斷的基因芯片研究及評價

任莉莉，從彥麗*

(深圳職業技術學院應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518055)

目的：建立應用基因芯片結合酪胺信號放大法檢測食源性疾病病原菌的方法。方法：針對細菌16S和23S rDNA基因設計各種病原菌診斷的特異性探針和通用引物。被檢測的病原菌經過生物素標記的引物進行PCR擴增，然后與制備的基因芯片探針區雜交，再用酪胺-Cy3進行顯色。最后通過熒光掃描儀掃描雜交圖像。結果：建立的基因芯片檢測方法用于診斷沙門菌、志賀菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌、霍亂弧菌、臘樣芽孢桿菌等8種細菌性傳染病病原菌。純培養物的檢測靈敏性達到5×102CFU/mL，對20例模擬雙盲樣本進行檢測，結果與預期的完全相符。結論：本方法特異性強、靈敏度高，可以用于傳染病防控和臨床診斷等多個領域。

病原菌；基因芯片；酪胺信號放大

細菌性食源性疾病在全世界公共衛生事件中占有較大的比例，也是我國傳染病預防控制的重點。其中病因主要有沙門菌、志賀菌、腸出血性大腸桿菌O157:H7、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌等病原菌所導致[1]。早期快速確診病原菌類型對于傳染病的防控、疾病治療均具有重要意義。病原菌形態和培養技術是作為細菌鑒定的“金標準”，但是由于培養周期長，培養條件各不相同，同時還要結合生化試驗及免疫學試驗才能對細菌類型進行判定，因此無法滿足傳染病防控的需要[2]。為研究一種能夠高通量、高靈敏性檢測多種細菌性傳染病病原菌的方法，本實驗選取細菌16S和23S rDNA基因建立對8種病原菌檢測的基因芯片方法，同時采用酪胺信號放大方法提高基因芯片檢測的靈敏度。

1 材料與方法

1.1 標準菌株及基因組DNA提取

腸出血性大腸桿菌O157:H7(ATCC43889)、志賀菌(ATCC25931)、副溶血性弧菌(ATCC20511)、沙門菌(ATCC43975)、臘樣芽孢桿菌(ATCC33019)、空腸彎曲菌(ATCC33560)、結腸彎曲菌(ATCC43478)、O1群霍亂弧菌(569B)、O139群霍亂弧菌(MO45)、單增李斯特菌(ATCC54001)、英諾克李斯特氏菌(ATCC33090)、西爾李斯特氏菌(ATCC35967)、格氏李斯特氏菌(ATCC25401)、威爾李斯特氏菌(ATCC35897)、糞腸球菌(ATCC14506) 標準菌株均購自上海漢尼生物技術有限公司，按照每種細菌的標準方法進行接種、分離培養。菌株基因組DNA提取采用上海超世生物科技有限公司試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書操作。提取的基因組DNA放置于-20℃保存，待用。

1.2 試劑與儀器

細菌常規培養試劑；Taq酶、dNTPs等PCR相關試劑 法國梅里埃公司；基因芯片片基、顯色液、雜交液 寶生物工程(大連)有限公司；酪胺-Cy3試劑 博奧生物科技有限公司。

9700 PCR儀 基因科技有限公司；4000B熒光掃描儀 美國ABI公司；凝膠成像系統 美國分子儀器公司；離心機 美國Bio-Rad公司；7500點樣儀 美國Cartesian公司。

1.3 引物和探針設計

表1 基因芯片引物與探針序列Table 1 Oligonucleotide primers and probes used in the present study

根據參考文獻[3-5]設計細菌16S和23S rDNA的通用引物，通過GenBank下載細菌相關16S rDNA 和 23S rDNA基因序列，采用clustalW和Genedoc軟件對序列進行比對，設計引物與文獻報道略有不同。下游引物5′端標記生物素基團，16S引物擴增長度為559bp，23S引物擴增長度為632bp。寡核苷酸探針設計在每種目的病原菌基因組兩對引物之間的可變區，在5′端標記氨基基團，同時連接一定長度的連接臂(10個T堿基)用于增加探針雜交的動力[6]；序列見表1，引物和探針在上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 靶基因擴增

采用雙重PCR進行擴增，體系如下：10×buffer 2.0μL，25mmol/L Mg2+1.2μL，200μmol/L dNTPs 1.6 μL，上游引物(23S-F和16S-F)分別為0.5μmol/L，下游引物(16S-R和16S-R)分別為0.3μmol/L，Taq聚合酶0.3U；模板基因組DNA 2.0μL(20～50ng/μL)，用去離子水補至20μL。在PCR儀上進行擴增，PCR反應條件為：95℃ 5min；進入循環95℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s，共35個循環；72℃ 1min。擴增后的產物可以用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5 基因芯片制備

參照文獻[3]報道，采用醛基化處理的玻璃片和點樣儀，基因芯片制備流程參照文獻[7]進行。制備的基因芯片矩陣圖如圖1所示。

圖1 基因芯片點樣矩陣圖Fig.1 Layout of oligonucleotide probes

1.6 基因芯片雜交與顯色

參照文獻[8-10]進行操作。吸取PCR產物10μL與10μL雜交液混勻后于100℃加熱變性10min，迅速滴加于基因芯片上探針區，將基因芯片放入鋪有吸水紙的盒中，保持一定濕度，避光，在55℃溫箱中放置1.5h。取出雜交盒，甩掉芯片上剩余的雜交液，用洗滌液清洗基因芯片，重復3次。待晾干后，在雜交區加入用PBS溶液按照1:1500稀釋的鏈酶親和素標記HRP，37℃避光放置30min；取出后用含0.05% 吐溫-20的PBS-T清洗1min，重復3次，置室溫晾干。用1×PBS加質量分數1% BSA配制的稀釋液將TSA-Cy3稀釋成1:1000，加入雜交區，37℃避光放置30min。取出后再用洗液洗滌，置室溫晾干。將基因芯片放入熒光掃描儀中掃描，圖像與基因芯片矩陣圖對比，對雜交結果進行判定。

1.7 模擬樣本制備

采用臨床健康人群糞便離心上清液混合不同的病原菌，在雙盲狀態下制備20例臨床模擬樣本。

2 結果與分析

2.1 靶病原菌特異性雜交

對8種細菌性傳染病病原菌沙門菌、志賀菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌、霍亂弧菌、臘樣芽孢桿菌以及屬內細菌進行基因芯片雜交。結果顯示篩選的探針具有很高的特異度。如圖2所示，靶病原菌對應探針和陽性對照探針均出現特異性信號，同時陰性探針沒有信號出現。其他非靶病原菌雜交只有陽性對照探針出現信號，說明本實驗選取的探針可以特異性的檢測8種靶病原菌。過培養和菌落計數，取培養到5×107CFU/mL，依次梯度10倍稀釋，制備成5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102、5×101CFU/mL等一系列靈敏性評價標準品。PCR擴增和基因芯片雜交后，檢測結果見圖3。從結果看出，5×102CFU/mL出現微弱的熒光信號，而5×101CFU/mL則沒有熒光信號產生，說明本項目所建立的檢測體系的靈敏性可達到5× 102CFU/mL，每次實驗重復3次。

2.3 模擬樣本檢測

為驗證基因芯片檢測的有效性，在雙盲狀態下制備20例臨床模擬樣本，對樣本進行基因組DNA提取，PCR擴增和基因芯片雜交。結果顯示與制備的病原菌類型完全一致，一種包括2例混合樣本，1例混合樣本含有沙門菌和腸出血性大腸桿菌O157:H7，1例含有副溶血性弧菌和霍亂弧菌，部分見圖4。

圖2 靶病原菌雜交結果Fig.2 Typical hybridization profiles from pure bacterial culture

2.2 基因芯片靈敏性評價

圖3 基因芯片檢測副溶血性弧菌靈敏性評價結果Fig.3 Evaluation of sensitivity for detecting Vibrio parahaemolyticus using DNA chip

選取副溶血性弧菌對基因芯片靈敏性進行考核，經

圖4 部分模擬樣本基因芯片檢測結果Fig.4 Partial DNA chip results for detecting intestinal pathogens from model samples

3 討 論

基因芯片是在20世紀90年代中期發展出來的一種集生物學、分子生物學、微電子學、材料學等多個學科的高科技技術。基因芯片基質一般是經過處理后的玻璃片、尼龍膜、塑料等，處理的方法一般有醛基化和氨基化[2]。目前，基因芯片檢測致病菌的方法均采用了通用引物擴增方法和特異性基因多重擴增方法，擴增的靶基因分為特異性毒力基因和通用基因。采用的檢測方法有熒光標記檢測方法和可見光標記顯色方法等等，標記的方法分為末端標記法、摻入法等[11]。上述諸多方法各具特點，本實驗選取病原菌核糖體16S和23S亞基基因，參照文獻設計引物和探針，采用酪胺-Cy3進行顯色，由于HRP(辣根過氧化物酶)能夠催化酪胺沉淀，因此相對于其他末端比較熒光素的方法，會在一定程度上提高檢測的靈敏性。

對于基因芯片檢測方法，篩選特異性高、結合能力強的探針是比較關鍵的。據文獻報道，核糖體基因具有高度保守的特性，可以作為細菌分類的依據。因此，選取病原菌核糖體基因作為檢測多種病原菌的靶基因，可以依靠通用性引物在少量PCR次數的基礎上實現對多種病原菌檢測。從本實驗結果可以看出，選取的特異性探針可以檢測和診斷對應的8種細菌性傳染病病原菌，對純培養細菌檢測的靈敏度可達到5×102CFU/mL，相當于在1個PCR擴增體系中少于1個CFU的細菌量。同時在對20例模擬雙盲樣本進行考核時，檢測的結果完全符合，其中包括2例模擬多種病原菌感染的樣本，說明該方法完全可以應用到臨床樣本的檢測。在后期的工作中，應該收集大量臨床樣本進行基因芯片檢測實際樣本的考核，同時研究更靈敏的顯色技術提高檢測的靈敏性，進一步優化并完善該基因芯片檢測的效果。

本實驗建立的基因芯片結合酪胺信號放大法檢測細菌性傳染病病原菌的方法，可以對沙門菌、志賀菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸桿菌O157: H7、單增李斯特菌、霍亂弧菌、臘樣芽孢桿菌等8種細菌性傳染病病原菌進行鑒定。純培養細菌檢測的靈敏性達到5×102CFU/mL。這種方法的建立為今后進一步擴大檢測范圍，增加靶病原菌數量提供參考。

[1]TAYLOR D N, ECHEVERRIA P. Diarrheal disease: current concepts and future challenges. Molecular biological app roaches to the epidemiology of diarrheal diseases in developing countries[J]. Trans R Soc Trop Med Hyg, 1993, 87(Suppl 3): 3-5.

[2]劉毅, 韓金祥. 生物芯片技術在臨床病原菌檢測中的新進展[J]. 中國實驗診斷學, 2006, 10(3): 325-328.

[3]JIN Dazhi, WEN Siyuan, CHEN Suhong, et al. Detection and identification of intestinal pathogens in clinical specimens using DNA microarrays [J]. Molecular and Cellular Probes, 2006, 20(6): 337-347.

[4]高爽, 謝明杰, 金大智, 等. 運用基因芯片技術建立檢測水產品食物中常見病原微生物方法的研究[J]. 生物技術通訊, 2007(18): 72-76.

[5]ANTHONY R M, BROWN T J, FRENCH G L. Rapid diagnosis of bacteremia by universal amplification of 23S ribosomal DNA followed by hybridization to an oligonucleotide array[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2000, 38(2): 781-788.

[6]顧鳴, 韓偉, 關嶸, 等. 常見食源性致病菌基因芯片鑒定技術[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2005, 15(11): 1309-1312.

[7]毛正果, 鄭浩軒, 王新穎, 等. 基因芯片檢測常見腸道致病菌感染的研究與評價[J]. 胃腸病學和肝病學雜志, 2008, 17(10): 809-812.

[8]SPEEL E J M, HOPMAN A H N, KOMMINOTH P. Amplification methods to increase the sensitivity of in situ hybridization: play CARD (S)[J]. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 1999, 47(3): 281-288.

[9]SPEEL E J M, RAMACEKERS F C S, HOPMAN A H N. Sensitivity multicolor fluorescence in situ hybridization using catalyzed reporter deposition (CARD) amplification[J]. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 1997, 45(10): 1439-1446.

[10]KERSTENS H M, PODDIGHE P J, HANSELAAR A G. A novel in situ hybridization signal amplification method based on the deposition of biotinylated tyramine[J]. J Histochem Cytochem, 1995, 43(4): 347-352.

[11]SCHENA M. Microarray Biochip Technology[M]. Natick, USA: Eaton Publishing, 2000.

Preliminary Study and Evaluation of DNA Chip for Diagnosing Foodborne Pathogenic Bacteria

REN Li-li，CONG Yan-li*
(School of Applied Chemistry and Biological Technology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen 518055, China)

Objective: To establish a method for detecting pathogenic bacteria quickly and accurately combinedly using DNA chip and tyramide signal amplification method. Methods: According to the sequences of 16S and 23S rDNA gene, common primer pairs and specific probes were designed. The primer pairs labeled with biotin group were used for PCR amplification, and then PCR products were hybridized with probes on the DNA chip. After the above process, the coloration was done using tyramide-Cy3. Finally, hybridization images were scanned by a fluorescence scanner. Results: Eight pathogenic bacteria were detected using this assay described here. The targets were Salmonella spp, Shigella spp, Vibrio parahaemolyticus, Campylobacter jejuni, Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Vibrio cholera, Bacillus cereus. The sensitivity of this assay was approximately 5 ×102CFU/mL for Vibrio parahaemolyticus. When 20 double-blind samples were detected, the results were in accordance with those of conventional methods. Conclusion: The specific and sensitive assay reported in the article can be applied for disease controlling and clinical diagnosis.

pathogenic bacteria；DNA chip；tyramide signal amplification

TS207.4；Q343.1

A

1002-6630(2011)04-0208-04

2010-03-19

深圳市科技計劃項目(07KJba165)

任莉莉(1977—)，女，講師，碩士，主要從事營養和食品安全、分子生物學研究。E-mail：475946790@qq.com

*通信作者：從彥麗(1966—)，女，副教授，碩士，主要從事生物活性物質、食品營養和安全研究。E-mail：congyl@szpt.net