真空包裝冷卻豬肉冷藏過程中菌相變化

江 蕓，高 峰，徐幸蓮，葉可萍，周光宏,*

真空包裝冷卻豬肉冷藏過程中菌相變化

江 蕓1,2，高 峰1，徐幸蓮1，葉可萍1，周光宏1,*

(1. 南京農業大學 國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇 南京 210095；2. 南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097)

應用傳統微生物培養和PCR-DGGE方法研究真空包裝冷卻豬肉4℃貯藏過程中的菌相變化。細菌培養計數結果表明，乳酸菌生長迅速，在貯藏后期即超過了細菌總數值。DGGE結合16S rRNA基因序列分析結果表明，貯藏初期肉中初始菌相較復雜，貯藏末期主要是漫游球菌、肉食桿菌、乳桿菌、乳球菌和熱死環絲菌成為優勢腐敗菌。

冷卻豬肉；真空包裝；菌相組成；聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電脈法(PCR-DGGE)

冷卻肉因微生物污染、繁殖極易導致腐敗變質，進而引發肉品安全問題。研究表明，真空包裝結合低溫貯藏可有效延長肉品貨架期[1]。冷卻肉真空包裝條件下貯藏過程中菌相的變化，基于傳統微生物培養計數的研究已有較多報道，許多研究均表明，真空包裝肉貯藏末期主要的腐敗菌是乳酸菌，如乳桿菌(Lactobacillus)、明串珠菌(Leuconostoc)、肉食桿菌(Carnobacterium)以及熱死環絲菌(Brochothrix thermosphacta)[1-3]。近年來，隨著分子生物學的發展，基于DNA指紋技術的分子生物學研究手段越來越多地被引入到微生物學包括食品微生物學研究中，例如變性梯度凝膠電泳法(denaturing gradient gel eletrophoresis，DGGE)、限制性片段長度多態性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、末端限制性片段長度多態性分析(terminal restriction fragment length polymorphism，TRFLP)、隨機擴增多態性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、單鏈構象多態性分析(single strand conformational polymorphism，SSCP)等。其中DGGE具有可靠性強、重現性高、方便快捷等優點而越來越受到重視，是近年來微生物學研究中應用較廣泛的分子技術之一。

DGGE技術是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于檢測DNA突變的一種電泳技術[4]。Muzyer等[5]首次將DGGE技術應用于微生物生態學研究，并證實了這種技術在研究自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異方面具有明顯的優越性。與傳統微生物學方法相比，DGGE可不采用培養方法，而從食物樣品中直接提取總DNA，這樣能檢測到難以培養或不能培養的微生物，能夠同時檢測多種微生物，而且檢測速度快。目前，DGGE技術在食品微生物研究方面有許多報道，如奶酪、香腸、酸面團、泡菜、葡萄酒等食品均有報道。近年來，應用DGGE技術研究不同包裝牛肉貯藏過程中的菌相變化亦有報道[6-8]，Li等[9]應用DGGE技術研究了真空包裝豬肉，但貯藏期僅6d。

本實驗將冷卻豬肉真空包裝低溫貯藏，在不同貯藏時期不經培養直接提取肉中細菌DNA，應用PCR-DGGE技術，研究菌相變化，揭示貯藏末期主要優勢腐敗菌，為進一步研究其保鮮措施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

由南京市某一冷卻豬肉專賣店購買兩條豬后腰肉(A組和B組)，由專賣店工作人員按正常操作程序分別切分成5塊，用潔凈包裝袋按組分別包裝，置于冰盒中于30min內送置實驗室，立即將每塊肉樣各放入一真空包裝袋中，包裝膜的氧氣通透率(O2transmission rate, OTR)為30cm3/(m2·24h·atm)，進行真空包裝(真空度0.1MPa，抽空時間30s，熱封溫度90℃，熱封時間5s)。分別標上A組和B組。4℃冰箱放置，分別于第0、3、10、17天和第24天每組各取1個包裝，取肉樣進行分析。

1.2 試劑與儀器

AxyPrep細菌基因組DNA小量試劑盒 美國Axygen公司；Wizard SV Gel and PCR Clean-up System純化試劑盒、GoTaq Green Master Mix (2×) 美國Promega公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、Tris、EDTA、TEMED、甘油、過硫酸胺、瓊脂糖 美國Sunshine公司；甲酰胺(分析純)；DNA Marker DL2000大連TaKaRa公司；Goldview染料 北京賽百盛公司；溴化乙錠(ethidium bromide，EB)應用液 美國Sigma公司；平板計數瓊脂(plate count agar，PCA)培養基、MRSA(de man rogosa sharpe agar)培養基 北京陸橋有限公司；所用引物均由上海Invitrogen公司合成。

BioRad DCode apparatus DGGE電泳儀、GelDoc 2000 system凝膠成像儀 美國BioRad公司；Mastercycler ep personalPCR儀 德國Enperndorf公司；水平電泳儀 北京百晶生物技術有限公司；DP12 Olympus顯微鏡 日本Olympus公司；DHZ-C恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設備廠；64R臺式高速冷凍離心機 美國Beckman公司；Anke TLG-16G臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；LX-100手掌型離心機 江蘇海門市其林貝爾公司；DZQ500/ 2SB真空充氣包裝機 浙江葆春包裝機械總廠；SW-CFIF超凈工作臺 蘇州安泰充氣技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物選擇性培養計數

無菌操作稱取冷卻豬肉25g，無菌剪刀剪碎，放入225mL滅菌生理鹽水中，充分振蕩15min，取1mL上清液進行10倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度，細菌總數采用PCA培養基37℃培養48h，乳酸菌采用MRSA培養基30℃培養48h[10]。培養結束后計數，結果以lg(CFU/g)表示。

1.3.2 直接提取冷卻肉細菌DNA

無菌剪取一定肉樣，用滅菌剪刀剪碎，精確稱取10g碎肉樣，放入滅菌錐形瓶(內有10g玻璃珠、100mL滅菌生理鹽水)，搖床280r/min、4℃條件振搖15min[9,11]，靜置5min，取30mL上清液于一滅菌離心管中，200×g離心5min后，取15mL上清液于另一滅菌離心管中，12000×g離心5min。離心所得沉淀，采用AxyPrep細菌基因組DNA提取試劑盒，方法稍作調整。沉淀加入150μL Buffer S懸浮，加入20μL溶菌酶(50mg/mL)，混勻，37℃孵育1h，加入30μL蛋白酶K(20mg/mL)，混勻，55℃孵育2～3h，然后繼續按試劑盒操作說明進行。提取的總DNA溶于80μLTE緩沖液，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20℃凍存。

1.3.3 巢式聚合酶鏈式反應(nested PCR)

采用巢式PCR擴增冷卻肉細菌16S rRNA基因V3可變區。第一輪PCR采用引物8f (5＇-GGA GAG TTT GAT CA/CT GGC T-3＇)和798r (5＇-CCA GGG TAT CTA ATC CTG TT-3＇)擴增約800bp的16S rRNA基因序列。PCR反應體系(25μL)：GoTaq Green Master Mix(2×)12.5μL，引物各1μL(0.4μmol/L)，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR擴增程序：94℃預變性2min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，25個循環；最后72℃再延伸2min[12]。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用純化試劑盒進行割膠純化，純化程序依據試劑盒使用說明進行。純化產物再次經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20℃凍存。

以上述純化產物為模板進行第二輪PCR反應，采用引物GC338f (5＇-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3＇)和518r (5＇-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3＇)，對細菌16S rRNA基因V3區片段進行“降落”PCR (touchdown PCR)擴增。PCR反應體系(50μL)：GoTaq Green Master Mix (2×) 25μL，引物各1μL(0.2μmol/L)，DNA模板1μL，ddH2O 22μL。PCR擴增程序：94℃預變性5min，然后采用touchdown PCR程序，即20個循環(94℃變性1min，退火溫度從65℃到55℃，退火30s，72℃延伸3min)，再于恒定的退火溫度下進行10個循環(94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸3min)，最后72℃再延伸10min[5,13]。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20℃凍存。

1.3.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

參照Muyzer等[5]方法，對細菌16S rDNA的V3區擴增產物進行DGGE分析。采用DGGE電泳儀，聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%(丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的質量比為37.5:1)，變性梯度為35%～55%(100%變性劑含有7mol/L尿素和40%甲酰胺)，在0.5×TAE緩沖液中，60℃恒溫條件下，先200V電壓預電泳10min，隨后再85V電壓電泳16h。

電泳結束后，將DGGE膠片用1×TAE(含0.5mg/L EB)染色15min。棄去染色液，再用ddH2O漂洗20min。染色后用凝膠成像系統照相。

1.3.5 DNA回收、純化和測序

將EB染色的V3區的DGGE膠片放置于紫外燈下，切下不同位置的條帶，分別放入1.5mL滅菌離心管中，加入20μL無菌水4℃冰箱過夜。取2μL為模板DNA以GC 338f/518r為引物進行16S rDNA V3區擴增，擴增方法同1.3.3節，PCR產物經DGGE后證明與所割條帶位于相同的遷移位置，再割膠回收，用不含GC夾子的引物再次擴增16S rDNA V3區序列，純化后送至上海Invitrogen生命技術有限公司測序。登錄NCBI(www. ncbi.nlm.nih,gov/blast/)，將所得序列與數據庫中的已知序列進行相似性比對[14]。

2 結果與分析

2.1 微生物培養結果

圖1 真空包裝冷卻豬肉貯藏過程中細菌總數和乳酸菌培養計數結果Fig.1 Counts of total bacteria and lactic acid bacteria in vacuumpackaged chilled pork during storage

由圖1可知，貯藏初期細菌總數對數值的平均值超過了4，乳酸菌低于細菌總數約0.5 lg(CFU/g)。隨著貯藏時間的延長，細菌總數和乳酸菌均逐漸增多，貯藏末期均達到了7 lgCFU/g以上。貯藏過程中，乳酸菌增長迅速，至第3天時已接近細菌總數值，至第10天時則超過了細菌總數值。

2.2 PCR-DGGE結果

采用巢式PCR，第一輪PCR采用引物8f/798r擴增出約800bp左右的預期條帶(圖2)，PCR產物采用試劑盒進行純化，純化產物采用引物GC338f/518r對細菌16S rDNA的V3區片段進行第二輪PCR擴增，得到約230bp的擴增產物。在變性梯度35%～55%進行DGGE，結果見圖3。

圖2 巢式PCR電泳結果Fig.2 Electrophoresis profile of nested PCR products

圖3 真空包裝冷卻豬肉直接提取細菌DNA的16S rRNA基因V3區DGGE圖譜Fig.3 DGGE profile of PCR products for the V3 region of 16S rRNA gene extracted from vacuum-packaged chilled pork

由圖3可知，貯藏初期產生了較多條帶，表明冷卻肉中初期污染有多種細菌；隨著貯藏時間的延長，條帶分布發生明顯變化，一些條帶逐漸變弱或消失，一些條帶由弱變強，還出現了一些新條帶；至貯藏末期，亮條帶主要位于圖譜上半部，表明貯藏過程中菌相組成發生了顯著變化。

2.3 割膠條帶測序及結果分析

對圖3 DGGE圖譜被分離的條帶1～15，經過割膠、擴增、測序，登錄NCBI用BLAST在GenBank數據庫中與參考序列進行相似性分析，結果如表1所示。各條帶相似性在98%以上。由圖3和表1可知，第0天時，肉中存在的初始污染菌有多種，有Serratia/Pseudomonas (沙雷氏菌屬/假單胞菌屬，條帶1和2)、Achromobacter (無色桿菌屬，條帶3)、Psychrobacter(條帶4)、Acinetobacter(不動桿菌屬，條帶5和6)、Lactococcus (乳球菌屬，條帶7)，表明貯藏初期肉中菌相較復雜。有些條帶未被測定，有些條帶測定失敗，圖中未標出。

隨著貯藏時間的延長，上述許多菌所對應的條帶逐漸變弱甚至消失，Proteobacterium對應的條帶10出現，Enterobacter/Hafnia(腸細菌屬/哈夫尼菌屬，條帶8)和Brochothrix thermosphacta(熱死環絲菌，條帶9)所對應的條帶逐漸增強，隨后它們又逐漸變弱，而乳酸菌所對應的很多條帶增強。至貯藏末期，除了熱死環絲菌，還有Vagococcus(漫游球菌屬，條帶12)、Carnobacterium(肉食桿菌屬，條帶13)、Lactobacillus (乳桿菌屬，條帶14)及Lactococcus(乳球菌屬，條帶15)成為最主要的細菌。

表1 DGGE條帶分離的細菌16S rRNA基因序列鑒定Table 1 DGGE bands identified by 16S rRNA gene sequencing

3 討 論

應用傳統微生物培養方法研究肉品真空包裝條件下貯藏過程中微生物的組成及變化已有許多報道[1-3]。本實驗直接提取肉樣細菌DNA，應用PCR-DGGE方法，研究真空包裝冷卻豬肉冷藏過程中的菌相變化，結果表明，貯藏初期主要有沙雷氏菌屬/假單胞菌屬、無色桿菌屬、不動桿菌屬、乳酸菌等。本實驗應用DGGE方法鑒定的冷卻肉中的初始菌相與大多數傳統微生物培養方法的研究報道一致[15-16]，但也有不同的報道，這可能是冷卻肉不同生產環境、不同加工工藝對豬胴體表面菌相會有影響[15]，另外本實驗并未對所有條帶進行鑒定。

真空包裝采用阻隔性能較好的包裝材料，除去包裝袋內的空氣，導致好氣性微生物的生長受到抑制，乳酸菌不斷增殖成為主要優勢菌，貨架期延長[1-2]。本實驗傳統培養方法的結果亦表明，真空包裝條件下乳酸菌生長迅速，貯藏后期即超過了細菌總數值。但由于本次實驗肉樣的初始菌數較高(＞4lg(CFU/g))，第10天時細菌總數平均值已超過6lg(CFU/g)。我國對冷卻肉的衛生指標尚無菌數指標，一般認為冷卻肉的細菌總數為6lg(CFU/g)時為警戒線，達到7lg(CFU/g)時冷卻肉外觀有明顯的腐敗現象，達到8lg(CFU/g)時外表有黏液形成，不宜食用，部分國家也把6lg(CFU/g)作為冷卻分割肉的細菌總數指標[17]。以此標準判斷，本實驗真空包裝冷卻豬肉4℃貯藏時貨架期不足10d。為了達到更好的貯藏效果，控制初始污染菌量非常必要。Egan[18]研究發現，真空包裝牛肉0℃下可貯藏10～12周，優勢乳酸菌主要是肉食桿菌屬、乳桿菌屬和明串珠菌屬。Nápravníková等[19]研究發現，真空包裝豬肉(2.5±0.5)℃條件貯藏，依據肉初始pH值的不同，貨架期在21～28d之間，乳酸菌增長迅速，應用API系統鑒定發現腐敗菌中主要為彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)和木糖乳桿菌(Lactobacillus xylosus)。Li等[9]同樣應用DGGE方法，對細菌16S rRNA基因V6～V8可變區的研究表明，真空包裝豬肉貯藏末期主要腐敗菌是乳桿菌和熱死環絲菌。本實驗應用DGGE結合16S rRNA基因序列分析，發現貯藏末期主要是多種乳酸菌(漫游球菌、肉食桿菌、乳桿菌、乳球菌)和熱死環絲菌，這可能也是由于冷卻肉生產加工環境的差異導致豬胴體表面初始菌相不完全相同[15]，進而影響到貯藏末期的菌相組成。

為了增加PCR反應的靈敏性，巢式PCR方法已被成功應用于低豐度微生物的分子生物學研究中[20-21]。本實驗中，直接提取冷卻豬肉細菌DNA，采用引物GC338f/518r對細菌16S rRNA基因V3區片段進行一次PCR擴增，結果貯藏前期所得的PCR產物條帶較弱(結果未顯示)，無法滿足進一步的DGGE分析所需，故為了增加靈敏性，本實驗亦采用了nested PCR方法，結果得到足夠的PCR產物，可用于進一步的DGGE分析。

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Microfloral Change of Vacuum-packaged Pork during Chilled Storage

JIANG Yun1,2，GAO Feng1，XU Xing-lian1，YE Ke-ping1，ZHOU Guang-hong1,*
(1. National Center of Meat Quality and Safety Control, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

The microfloral change in vacuum-packaged pork during 4 ℃ storage was explored by traditional bacterial cultivation and PCR-denaturing gradient gel eletrophoresis (PCR-DGGE). Results indicated that lactic acid bacteria (LAB) exhibited a rapid increase and excessive total bacterial counts in the late stage during chilled storage. DGGE combined with the analysis of 16S rRNA gene sequence revealed a complex microflora in chilled pork at the early stage during chilled storage; in contrast, Vagococcus, Carnobacterium, Lactobacillus and Lactococcus, and Brochothrix thermosphacta were the predominant spoilage bacteria at the end of storage period.

chilled pork；vacuum package；microfloral composition；polymerase chain reaction-denaturing gradient gel eletrophoresis (PCR-DGGE)

TS251.51

A

1002-6630(2011)04-0241-05

2010-04-06

國家“863”計劃項目(2008AA100804)；江蘇省高校自然科學基礎研究項目(08KJB550005)；

上海市科學技術委員會重大攻關項目(07dz19508)

江蕓(1971—)，女，副教授，博士研究生，研究方向為肉品安全與質量控制。E-mail：jiangyun@njnu.edu.cn

*通信作者：周光宏(1960—)，男，教授，博士，研究方向為肉品科學。E-mail：ghzhou@njau.edu.cn