硬溶質型桃果實成熟過程中細胞壁多糖降解特性及其相關酶研究

闞 娟，劉 濤，金昌海,*，謝海艷

硬溶質型桃果實成熟過程中細胞壁多糖降解特性及其相關酶研究

闞 娟1，劉 濤1，金昌海1,*，謝海艷2

(1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2.揚州大學生物科學與技術學院， 江蘇 揚州 225009)

以硬溶質型桃‘晚湖景’為試材，研究細胞壁多糖降解以及細胞壁多糖降解相關酶對硬溶質型桃果實成熟軟化的影響。結果表明：硬溶質型桃果實成熟過程中，CDTA-1果膠含量上升，兩種Na2CO3溶性果膠含量在成熟末期減少率分別為22.5%和27.4%。KOH溶性果膠含量在整個成熟過程中變化不明顯。果實CDTA、Na2CO3組分中果膠多糖主鏈的斷裂、半纖維素和纖維素組分中阿拉伯糖和半乳糖的降解主要發生在成熟末期；β-半乳糖苷酶(β-Gal)與桃果實成熟軟化啟動密切相關，多聚半乳糖醛酸酶(PG)和纖維素酶(Cx)對桃果實成熟后期快速軟化起重要作用。Na2CO3-1溶性果膠多糖的降解與硬溶質型果實采后軟化密切相關，KOH-1、KOH-2半纖維素多糖的降解可能促進硬溶質型桃果實成熟軟化進程，富含半乳糖醛酸的果膠多糖主鏈的斷裂以及果膠、半纖維素、纖維素中阿拉伯糖、半乳糖等中性糖的降解都可能是果肉軟化的重要因素，并有多種多糖降解酶參與其中。

桃；成熟軟化；細胞壁多糖；單糖組成

桃果實成熟過程中果肉硬度下降可分為兩個階段，在成熟早期，果肉硬度不斷下降但很慢；在成熟的后期，果肉硬度下降很快，這一階段也被叫做“溶質”階段[1]。桃根據果肉結構常被分為兩大類：溶質型桃和硬肉型桃(stony-hard-flesh)。而溶質型桃又細分為軟溶質型(melting-flesh)和硬溶質型(non-melting-flesh)[2]。成熟的桃無論是軟溶質型還是硬溶質型在其成熟過程中都會產生乙烯。軟溶質型桃的特點是成熟過程中乙烯大量釋放，果肉迅速軟化，而硬溶質型桃的軟化過程會受到更多的限制，成熟過程中乙烯釋放一直很少，軟化過程緩慢，果肉堅硬，直到后期在溶解的時候，才會通過不停的釋放乙烯來加速其軟化，有著很高的保鮮品質，在市場上的流通時間和供貨期比普通的軟溶質型水蜜桃明顯延長。目前，對桃果實的研究主要集中在軟溶質型桃果實，系統全面的研究硬溶質型桃果實成熟過程中各細胞壁多糖組分的降解特性以及相關降解酶在桃果實軟化中的作用鮮有報道。本實驗以硬溶質型桃‘晚湖景’為試材，分析細胞壁多糖降解以及細胞壁多糖降解相關酶對硬溶質型桃果實成熟軟化的影響，探討硬溶質型桃果實成熟軟化的機理，為完善桃果實成熟軟化機理及延長貯藏期的研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試桃品種為‘晚湖景’，采自無錫陽山，分批采收后即刻運抵實驗室，剔除病果、傷果，選取大小相近的按成熟度不同分為四組。

成熟度Ⅰ：表示成熟前期，果皮顏色白綠，基部很硬；成熟度Ⅱ：表示開始成熟，果皮顏色黃帶微紅，基部很硬；成熟度Ⅲ：表示中等成熟，果皮顏色有二分之一左右為紅色，基部很硬；成熟度Ⅳ：表示完全成熟，果皮顏色全紅，基部較硬。

在采收當天去掉果皮和果核，將果肉部分切成小塊，用液氮處理后裝在聚乙烯薄膜塑料袋中，并立即保存于-80℃超低溫冰箱中用于試驗分析。

1.2 試劑與儀器

對硝基酚半乳糖苷、對硝基酚、多聚半乳糖醛酸、D-半乳糖醛酸 美國Sigma公司；鼠李糖、半乳糖醛酸、巖藻糖、CDTA 瑞士Fluka公司；阿拉伯糖 上海悅耳化學品有限公司；木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、肌醇為色譜純；甲醇為優級純；氫氧化鉀、吡啶、三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、乙酰氯、乙醇、氯仿、正己烷、丙酮、無水碳酸鈉、氯化鈉、硫酸銨、醋酸鈉、硼氫化鈉等為分析純。

GY-1型果實硬度計 牡丹江市機械研究所；GC-14B型氣相色譜儀 日本島津公司；RE-52型旋轉蒸發器 上海青浦滬西儀器廠；5804R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 果實硬度的測定

采用果實硬度計(測頭直徑為3.5mm)測定去除果皮后果肉的硬度。

1.4 乙烯釋放量的測定

參照Jin等[3]的方法。氣相色譜條件為：FID檢測器，SPB-1毛細管柱(0.25mm×30m，0.25μm)，載氣為N2，柱溫40℃，檢測器溫度120℃，重復3次。

1.5 果實細胞壁物質(cell wall materials，CWM)提取

參照Rose等[4]的方法進行。

1.6 果實細胞壁多糖的分步提取

參照Brett等[5]和金昌海等[6]的方法。稱取上步所得CWM 0.5g，依次用50mL 50mmol/L pH6.5環己二胺四乙酸(CDTA)于20℃振蕩提取5、2h；50mL 50mmol/L Na2CO3(含20mmol/L NaBH4)溶液1℃通N2振蕩提取20h，20℃通N2振蕩提取2h，0.5、1.0、4.0mol/L KOH(含20mmol/L NaBH4) 20℃通N2振蕩提取2h。每步所得混和物 4℃離心分離，上清液過濾，濾渣加入沉淀，沉淀用蒸餾水洗1次，水洗液加入上清中。上清液和最終所得不溶物(CWM-殘渣) 4℃透析充分(透析袋分子質量截留值3500D)。35℃減壓濃縮，凍干，稱質量，分別得CDTA-1、CDTA-2、Na2CO3-1、Na2CO3-2、KOH-1、KOH-2、KOH-3、CWM-殘渣8種細胞壁多糖物質。每樣重復3次，結果用平均值表示。所提多糖樣品真空干燥保存待分析。

1.7 細胞壁多糖中單糖組成色譜分析

參照Jin等[3]方法，采用GC-14B氣相色譜儀，OV-1氣相色譜柱(30m×0.25mm，0.33μm)，FID檢測器。載氣N2，氫氣流量60mL/min，進樣量1μL，檢測器及進樣溫度250℃。柱溫采用程序式升溫：起始柱溫150℃，保持1min，10℃/min升至200℃，保持10min，5℃/min升至220℃，保持10min，5℃/min升至240℃，保持1min。用肌醇作為內標物。

1.8 酶活性測定

多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)活性測定：參照Huber等[7]方法；果膠甲酯酶(pectin methylesterase，PME)活性測定：參照Hagerman等[8]方法；纖維素酶活性測定：參照Xu等[9]方法；β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性測定：參照金昌海等[6]方法。

2 結果與分析

2.1 桃果實成熟過程中硬度和乙烯釋放量的變化

果實硬度是反映果實質地的一個重要指標，也是反映果實成熟衰老的重要指標之一。如圖1所示，硬溶質型桃果實在成熟前期硬度下降不明顯，一直保持較高的硬度，到成熟度Ⅳ時迅速下降。表明硬溶質型桃硬度下降只出現在成熟末期。軟溶質型桃果實在成熟中期硬度就開始迅速下降[10]。可以看出，硬溶質型與軟溶質型桃果實相比，成熟過程中硬度有更長的保持期。

圖1 桃果實成熟過程中硬度的變化Fig.1 Change in firmness during maturation of peach fruit

如圖2所示，硬溶質型桃果實成熟過程中，成熟前期乙烯釋放量很低，成熟度Ⅲ乙烯釋放開始增加，到成熟度Ⅳ時乙烯釋放顯著增加，是成熟度Ⅱ乙烯釋放量的14倍，乙烯釋放量最高。硬溶質型桃果實同一時期乙烯釋放量明顯低于軟溶質型[10]，到成熟末期才有大量釋放，而且乙烯釋放高峰明顯推遲。

圖2 桃果實成熟過程中乙烯釋放量的變化Fig.2 Change in ethylene production during maturation of peach fruit

2.2 桃果實成熟過程中細胞壁多糖組分含量的變化

表1 桃果實成熟過程中細胞壁多糖組分含量的變化Table 1 Quantitative changes in various cell wall polysaccharides during maturation of peach fruit mg/100g

由表1可以看出，硬溶質型桃果實樹體成熟過程中CDTA-1和CDTA-2溶性果膠多糖都逐漸增大。兩種Na2CO3溶性果膠含量在成熟末期下降明顯，減少率為22.5%和27.4%。KOH溶性果膠含量在整個成熟過程中變化不明顯。由此看出，硬溶質型桃果實的軟化特性與Na2CO3溶性果膠多糖等細胞壁多糖組分的降解密切相關。對軟溶質型桃果實的研究發現[11]，除了兩種Na2CO3溶性果膠含量下降明顯外，KOH-1、KOH-2、CWM-殘渣等組分含量在果實成熟軟化過程中也逐漸下降。

2.3 桃果實成熟過程中CDTA溶性果膠中單糖組成的變化

用50mmol/L CDTA提取的兩種螯合劑溶性果膠主要為離子結合型果膠，20℃提取溫度有利于最大限度地減少果膠在提取過程中的降解。CDTA-1組分主要為以Ca2+鉸鏈的半乳糖醛酸聚糖主鏈，主鏈上間隔插入單個鼠李糖殘基。而用CDTA溶液提取5h后，再在相同條件下提取2h所得的CDTA-2組分中還含有富含羥脯氨酸的糖蛋白。由表2可以看出，構成CDTA-1和CDTA-2溶性果膠多糖組分的單糖中半乳糖醛酸的含量明顯高于其他單糖，且在成熟過程中發生了明顯的降解。CDTA-1組分中半乳糖醛酸與鼠李糖含量比值由成熟度Ⅰ的17.18、成熟度Ⅱ的20.06、成熟度Ⅲ的17.5下降到成熟度Ⅳ的7.05，該比值在CDTA-2組分中由成熟度Ⅰ的11.98、成熟度Ⅱ的10.96下降至成熟度Ⅲ的7.63、成熟度Ⅳ6.88，說明在硬溶質型桃果實中，兩種CDTA溶性果膠多糖中主鏈半乳糖醛酸的降解主要發生在成熟后期，而軟溶質型桃果實成熟前期才是果膠主鏈半乳糖醛酸的快速下降時期[11]。衡量果膠多糖主鏈變化指標，即半乳糖醛酸與鼠李糖含量比值在CDTA-1、CDTA-2中隨著果實硬度的下降而迅速下降。

構成細胞壁果膠多糖主鏈的半乳糖醛酸聚糖(homogalacturonan，HGA)是由半乳糖醛酸組成，鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ(rhamnogalacturonanI，RG-Ⅰ)是由半乳糖醛酸和鼠李糖組成，阿拉伯糖、半乳糖是構成RG-Ⅰ側鏈的主要成分。分析結果表明，桃果實CDTA溶性果膠多糖組分中富含HGA主鏈和少量帶有阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯聚糖和半乳聚糖等側鏈成分的RG-Ⅰ，說明桃果實細胞壁中多聚半乳糖醛酸與富含阿拉伯聚糖、半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖支鏈的鼠李糖半乳聚糖相互交聯在一起[12-13]。果膠內半乳糖糖醛酸的支鏈富含阿拉伯糖、半乳糖。它們的解離，會分別導致阿拉伯糖與鼠李糖含量的比值、半乳糖與鼠李糖含量的比值的下降。 CDTA-1組分中阿拉伯糖與鼠李糖的比值由成熟度Ⅰ的7.82下降到成熟度Ⅳ的5.38。半乳糖與鼠李糖的比值由成熟度Ⅰ的13.59下降至成熟度Ⅳ的5.25。成熟末期支鏈阿拉伯糖和半乳糖都發生了明顯的降解。CDTA-2組分中阿拉伯糖與鼠李糖的比值成熟度Ⅰ和成熟度Ⅳ分別為6.6和6.2，降解不明顯。半乳糖與鼠李糖的比值由成熟度Ⅰ的10.37下降至成熟度Ⅳ的6.03。由此可見，在硬溶質型桃果實樹體成熟后期CDTA溶性果膠中主鏈半乳糖醛酸，支鏈阿拉伯糖、半乳糖發生了明顯的降解，明顯滯后于軟溶質型桃果實[11]。衡量果膠支鏈變化的指標，半乳糖與鼠李糖含量的比值以及阿拉伯糖與鼠李糖含量的比值在CDTA-1、CDTA-2組分中的下降也說明了果膠中半乳糖、阿拉伯糖這兩種支鏈中性糖的降解與硬溶質型桃果實的成熟軟化密切相關。

表2 桃果實成熟過程中CDTA溶性果膠多糖的單糖組分摩爾分數變化Table 2 Changes in monopolysaccharide composition of CDTA fractions during maturation of peach fruit %

2.4 桃果實成熟過程中Na2CO3溶性果膠中單糖組成的變化

用50mmol/L Na2CO3(含20mmol/L NaBH4)在不同溫度下提取的多糖成分，主要為共價結合型果膠鼠李半乳糖醛酸聚糖，先在1℃條件提取該果膠，有利于消除以后堿提取操作中由β-消去而發生的多糖解聚。由表3可以看出，Na2CO3溶性果膠成分中含有大量半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖等果膠特性單糖成分，證明了該果膠半乳糖醛酸和鼠李糖構成的主鏈上連接有富含阿拉伯糖、半乳糖的支鏈[12-13]。Na2CO3溶性果膠多糖成分的單糖類中半乳糖醛酸摩爾分數相對于CDTA溶性果膠多糖明顯減少，阿拉伯糖和半乳糖摩爾分數較高，表明桃果實Na2CO3溶性果膠多糖成分有別于CDTA溶性果膠多糖，其多糖組分中富含RG-Ⅰ主鏈成分，并帶有阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯聚糖和半乳聚糖等側鏈，構成了結構比較復雜的果膠多糖。硬溶質型桃果實Na2CO3-1組分中，果膠鼠李半乳糖醛酸聚糖主鏈在成熟后期迅速降解，而軟溶質型桃果實果膠鼠李半乳糖醛酸聚糖主鏈主要發生在前期[11]。支鏈半乳糖與鼠李糖含量的比值由成熟度Ⅰ的10.36迅速降至成熟度Ⅳ的8.68，在果實成熟前期變化不明顯。半乳糖醛酸與鼠李糖含量比值在Na2CO3-1中隨著果實硬度的下降而迅速下降。在Na2CO3-2組分中，果膠支鏈阿拉伯糖降解最為明顯，成熟度Ⅰ阿拉伯糖與鼠李糖含量比值為7.57，成熟度Ⅳ該比值為5.17，說明該組分中阿拉伯糖的降解主要發生在果實樹體成熟后期，這與軟溶質型桃果實相似[11]。

表3 桃果實成熟過程中Na2CO3溶性果膠多糖的單糖組分摩爾分數變化Table 3 Changes in monopolysaccharide composition of Na2CO3soluble fractions during maturation of peach fruit%

2.5 桃果實成熟過程中KOH溶性半纖維素中單糖組成的變化

KOH-1、KOH-2主要為與細胞壁結合疏松的半纖維素多糖，KOH-3主要為與細胞壁結合緊密的半纖維素多糖。由表4可以看出，桃果實KOH溶性多糖組分中最顯著的特點就是木糖和葡萄糖等半纖維特征性單糖的摩爾分數相對于CDTA、Na2CO3溶性果膠多糖明顯增多，同時阿拉伯糖和半乳糖的摩爾分數也較高，而半乳糖醛酸的摩爾分數卻明顯減少。說明KOH溶性多糖組分中富含以木葡聚糖為主鏈的半纖維素多糖成分，而且由一定量的果膠嵌入半纖維素中形成網絡狀結構，這種交聯是RG-Ⅰ主鏈通過側鏈相聯系而形成骨架[14]。在硬溶質型桃果實樹體成熟過程中，KOH溶性多糖組分組成側鏈的阿拉伯糖和半乳糖的摩爾分數逐漸減少。

KOH-1組分中，阿拉伯糖的摩爾分數由成熟度Ⅰ的14.10%逐漸下降至成熟度Ⅳ的11.02%，半乳糖的摩爾分數下降不明顯。KOH-2組分中，阿拉伯糖的摩爾分數從成熟度Ⅰ的6.90%、成熟度Ⅱ的7.34%、成熟度Ⅲ的7.01%下降至成熟度Ⅳ的4.89%，半乳糖摩爾分數也由成熟度Ⅰ的25.05%逐漸下降至成熟度Ⅳ的24.46%。KOH-3組分中，阿拉伯糖和半乳糖摩爾分數在成熟后期也明顯下降。與硬溶質型桃果實不同，軟溶質型桃果實半乳糖的降解只發生在與細胞壁連接松散的半纖維素多糖中，在緊密連接的半纖維素多糖中未發生降解[11]。主鏈木葡聚糖成分中木糖和葡萄糖的摩爾分數沒有減少，可見桃果實樹體成熟過程中KOH溶性多糖組分摩爾分數的減少受木葡聚糖側鏈或存在于KOH溶性多糖組分中果膠多糖側鏈結構變化的影響，半纖維素多糖組分中阿拉伯糖、半乳糖等中性糖的降解與果肉的軟化有密切的聯系。

表4 桃果實成熟過程中KOH溶性半纖維素多糖的單糖組分摩爾分數變化Table 4 Changes in monopolysaccharide composition of KOH soluble fractions during maturation of peach fruit%

2.6 桃果實成熟過程中CMW-殘渣中單糖組成的變化

CWM-殘渣為KOH不溶物，主要成分為纖維素，由表5可以看出，CMW-殘渣多糖組分中含有大量的阿拉伯糖和半乳糖成分，可能是桃果實細胞壁多糖中果膠多糖能緊密結合到纖維素上，或者是這些多糖鏈比較復雜，物理結構上相互纏繞，因此不為高濃度的KOH降解。果膠通過RG-Ⅰ的阿拉伯糖和半乳糖側鏈錨定在細胞壁上，或者通過共價鍵連接到基質多糖-纖維素網絡，氫鍵連接到纖維素[14]，或者通過物理纏繞結合到其他細胞壁多聚體。Redgwell等[15]選取8個不同物種的KOH提取后的殘渣，加入從番茄中純化的內切PG酶，從中釋放出一半的阿拉伯糖，說明一定比例的果膠關聯到纖維素，并不是通過側鏈，而是通過多聚半乳糖醛酸骨架。阿拉伯糖的摩爾分數從成熟度Ⅲ的22.06%下降至成熟度Ⅳ的16.70%，半乳糖摩爾分數從成熟度Ⅲ的37.04%下降至成熟度Ⅳ的32.91%，在硬溶質型桃果實成熟后期阿拉伯糖和半乳糖顯著減少。軟溶質型桃果實中主要是半乳糖的解離，且主要發生在成熟前期[11]。

表5 桃果實成熟過程中CMW-殘渣纖維素多糖的單糖組分摩爾分數變化Table 5 Changes in monopolysaccharide composition of CMW-residue fractions during maturation of peach fruit %

2.7 桃果實成熟過程中PG、PME、纖維素酶和β-半乳糖苷酶活性的變化

PG能夠水解切開α-(1,4)半乳糖糖苷鍵，斷裂多聚半乳糖醛酸鏈，將果實細胞壁中多聚半乳糖醛酸降解為寡聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸，使細胞壁結構解體，導致果實軟化。如圖3所示，在硬溶質型桃果實成熟過程中，成熟前期PG活性很低，隨著果實硬度下降和乙烯釋放量的增加，PG活性逐漸增加，在成熟度Ⅳ時PG活性達到最高值為1.37mg/(g·h)。與軟溶質型桃果實相似[10]，PG活性高峰都出現在成熟后期，表明該酶對桃果實成熟后期快速軟化起重要作用，只是硬溶質型桃果實中PG活性高峰來的更遲。

PME能夠去除多聚半乳糖醛酸的半乳糖醛酸殘基的C6酯化基團，催化果膠酯酸轉化為果膠酸，以利于PG發揮其生理作用。如圖3所示，PME活性在整個成熟過程中呈現明顯的上升趨勢，成熟前期，PME活性很低，隨著果實成熟，PME活性逐漸增大，同PG活性表現出相同的變化趨勢。在PME的作用下，果膠甲酯化程度降低，更有利于PG對果膠的水解作用。PME在軟溶質型桃果實中比硬溶質型更早的發揮作用[16]。

纖維素酶是在細胞壁降解過程中起重要作用的一種細胞壁酶，能夠分解含β-(1,4)糖苷鍵的半纖維素，但并不作用于水溶性纖維素。纖維素酶使纖維素降解，從而導致細胞壁纖維素微纖絲-半纖維素-果膠質“經緯結構”的松散。果膠酶趁機分解果膠質，導致果實成熟軟化過程的進行。由圖3可以看出，在硬溶質型桃果實成熟前期，纖維素酶活性變化不明顯，都保持在3.6mg/(g·h)左右，直到成熟后期，活性才突然增加至5.3mg/(g·h)。由此看出，纖維素酶在硬溶質型桃果實前期軟化中的作用不明顯，主要在后期起作用。

β-Gal作用于鼠李半乳聚糖骨架的支鏈殘基，降解果膠聚合體，破壞細胞壁結構，從而使果實軟化。如圖3所示，硬溶質型桃果實β-Gal活性在成熟前期迅速上升，在成熟度Ⅲ達到最大值，隨后又逐漸降低。軟溶質型桃果實β-Gal活性在成熟Ⅰ最高，比硬溶質型桃果實更提前發揮作用[10]。由β-Gal在成熟前期到中期時活性的快速增加可以看出，β-Gal不僅與桃果實成熟軟化密切相關，而且其對桃果實軟化的作用不同于PG，它主要與桃果實成熟前期的果實軟化啟動相關。

圖3 桃果實成熟過程中細胞壁降解相關酶活性的變化Fig.3 Changes in the activities of several enzymes related to cell wall degradation during maturation of peach fruit

3 討 論

果實硬度是反映果實軟化的重要外在指標。果實成熟時最顯著的變化特征就是果肉硬度的變化。本實驗研究發現，硬溶質型桃果實在樹體成熟過程中，硬度下降只出現在成熟末期，前期一直保持較高的硬度(圖1)，軟溶質型桃果實在成熟中期硬度就開始迅速下降[10]。硬溶質型與軟溶質型桃果實相比，成熟過程中硬度有更長的保持期，更利于采后貯藏，延長貨架期。

乙烯誘導了果實的成熟，所以要控制果實成熟必須要控制乙烯的生成[17]。與軟溶質型桃果實相比[10]，硬溶質型桃果實同一時期乙烯釋放量明顯低于軟溶質型，到成熟末期才有大量釋放，而且乙烯釋放高峰明顯推遲。說明硬溶質型桃果實更利于采后貯藏的特性與其生理生化變化密切相關。

高等植物細胞壁的共同特征是均由纖維素、半纖維素、果膠物質和糖蛋白等大分子組成。Trainotti等[18]對桃果實細胞壁基因組表達的分析結果表明桃果實的軟化過程極為復雜，有許多酶類參與其中。果實成熟軟化過程中，在各種酶的作用下，溶解度較低的高分子質量細胞壁多糖發生降解或解聚，使得大分子長鏈多糖的含量減少，溶解度較大的小分子質量組分含量增多，從而造成果實細胞壁 CDTA組分含量增多，與芒果[19]、甜瓜[20]等水果成熟過程中CDTA溶性果膠含量增加結果相一致，而其他多糖組分摩爾分數逐漸減少[21](表1)。由單糖成分分析結果推測，衡量果膠多糖主鏈變化指標，即半乳糖醛酸與鼠李糖含量比值在CDTA-1、CDTA-2、Na2CO3-1中隨著果實硬度的下降而迅速下降(表2、3)。說明桃果實樹體成熟過程中，尤其在成熟后期，富含半乳糖醛酸的果膠主鏈發生了斷裂。研究表明，甜瓜[20]等果實的成熟軟化過程中細胞壁半纖維素多糖的變化與果實的成熟軟化有緊密的聯系。半乳糖含量在KOH-2、KOH-3、CWM-殘渣組分中，阿拉伯糖含量在KOH-1、KOH-2、KOH-3、CWM-殘渣組分中的下降，說明了硬溶質型桃果實細胞壁半纖維素、纖維素多糖組分中這兩種支鏈中性糖的解離可能是多糖解聚、果實變軟的原因之一。因此看出，桃果實成熟軟化過程中細胞壁多糖的變化非常復雜，富含半乳糖醛酸的果膠多糖主鏈的斷裂以及果膠、半纖維素、纖維素中阿拉伯糖、半乳糖等中性糖的降解都可能是果肉軟化的重要因素，并有多種多糖降解酶參與其中。

硬溶質型桃果實樹體成熟過程中，果實CDTA、Na2CO3組分中果膠多糖主鏈的斷裂(表2、3)、半纖維素和纖維素組分中阿拉伯糖和半乳糖的降解主要發生在成熟末期(表4、5)，而軟溶質型桃果實多糖主鏈斷裂和支鏈降解主要發生在成熟中后期[11]，說明細胞壁多糖的降解與各類型桃果實的軟化進程密切相關。硬溶質型桃果實成熟過程中KOH-1、KOH-2組分中組成側鏈的阿拉伯糖逐漸下降，半乳糖下降不明顯。KOH-3組分中，阿拉伯糖和半乳糖含量在成熟后期也明顯下降(表4)。而軟溶質型桃果實半乳糖的降解只發生在與細胞壁連接松散的半纖維素多糖中，在緊密連接的半纖維素多糖中未發生降解[11]。CMW-殘渣組分在硬溶質型桃果實成熟后期阿拉伯糖和半乳糖顯著減少，軟溶質型桃果實CMW-殘渣組分中主要是半乳糖的解離，且解離主要發生在成熟前期[11]。這可能跟果實品種細胞壁結構的差異性和果實成熟過程中細胞壁多糖降解相關酶在不同品種間發揮功效的時間和作用不盡相同有關。

對果實成熟過程中多種細胞壁降解酶編碼基因表達水平變化的研究表明，果實的成熟軟化與多種多糖降解酶活性密切相關[22]。PG在果實軟化中主要作用于富含半乳糖醛酸的多糖主鏈，是細胞壁多糖主鏈斷裂的重要作用酶，有關PG在果肉軟化中的重要作用已在許多果實中得以證明，在桃果實樹體成熟過程中能造成長而細的果膠多聚體解聚，成為短而粗的多聚體。PME能夠去除多聚半乳糖醛酸的半乳糖醛酸殘基的C6酯化基團，催化果膠酯酸轉化為果膠酸，以利于PG發揮其生理作用。纖維素酶能夠分解含β-(1,4)糖苷鍵的半纖維素。β-Gal能切除多糖側鏈中非還原末端半乳糖殘基，可造成細胞壁多糖中半乳糖、阿拉伯糖含量的降低，阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯苷露聚糖等多聚物的解聚。在蘋果果實成熟前期β-Gal活性較低，完熟后達到最高，但是在整個生長成熟過程中β-Gal總的活性沒有變化[23]。本實驗研究表明，β-Gal作用下的支鏈半乳糖的降解則可能與果實成熟軟化啟動密切相關(圖3)。硬溶質型桃果實樹體成熟過程中PG及其起輔助作用的PME變化趨勢大致相同，活性都在成熟后期達到最大(圖3)，纖維素酶也在成熟后期活性增大(圖3)。PG和纖維素酶對桃果實成熟后期快速軟化起重要作用。PG、PME、纖維素酶和β-Gal都是硬溶質型桃果實成熟軟化的重要作用酶，分別在果實成熟的不同階段起作用。研究發現，與硬溶質型相比，細胞壁多糖降解相關酶活性高峰更早的在軟溶質型桃果實中表現出來，這可能是導致軟溶質型桃果實在樹體成熟過程中更容易軟化的原因之一。

桃果實的成熟軟化受到多種內外因素的影響，乙烯的積累與多糖降解相關酶的表達以及對酶蛋白激活的作用都有待于進一步的證實。為此，可以采用分子生物學手段進一步研究乙烯的生物合成與細胞壁多糖降解酶以及它們之間的相互關系對桃果實成熟軟化的作用。

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Degradation of Cell Wall Polysaccharides and Related Enzyme Activities during Non-melting-flesh Peach Fruit Softening

KAN Juan1，LIU Tao1，JIN Chang-hai1,*，XIE Hai-yan2
(1. College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China；2. College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

As a representative of non-melting-flesh peach, Wanhujing peach cultivar was used to investigate the degradation of cell wall polysaccharides in non-melting-flesh peach during its softening and the activities of related enzymes. During peach fruit ripening, CDTA-1 pectin content increased, and the contents of two kinds of Na2CO3 soluble pectin were decreased by 22.5% and 27.4% until the late stage. KOH soluble pectin content did not change significantly throughout the ripening process. The degradation of pectin main chains in CDTA and Na2CO3and the loss of arabinosyl and galactosyl from pectin side chains in cellulosic polysaccharides mainly happened at the end of the ripening process. β-galactosidase was associated with the startup of peach fruit softening. Polygalacturonase and Cx-Cellulase were important enzymes that contributed to the end of peach fruit softening. Na2CO3-1 pectin was an important factor affecting non-melting-flesh peach fruits softening. The degradation of KOH-1 and KOH-2 fractions may promote peach fruit softening. The fracture of pectin chain rich in galacturonic, as well as the degradation of neutral sugars such as arabinose and galactose in pectin, hemicellulos and cellulose, and a variety of polysaccharides degrading enzyme were likely to be important factors affecting non-melting-flesh peach fruit softening.

peach；ripening and softening；cell wall polysaccharides；monopolysaccharide composition

TS255.3；S662.1

A

1002-6630(2011)04-0268-07

2010-05-25

國家自然科學基金項目(30840016)；江蘇省自然科學基金項目(BK2010310)；

江蘇省高校自然科學研究項目(10KJB550004)

闞娟(1980—)，女，講師，博士研究生，研究方向果蔬采后生理與分子生物學。E-mail：kanjuan@yzu.edu.cn

*通信作者：金昌海(1963—)，男，教授，博士，研究方向為果蔬采后生理與分子生物學。E-mail：chjin@yzu.edu.cn