穿通支原體感染對成人原發性IgA腎病患者外周血T細胞亞群的影響

史艷玲 許菲菲 章建娜

穿通支原體(Mycoplasma penetrans，Mpe)是近年來新發現的致病性支原體，因在HIV感染及AIDS的發病進程中起輔助作用，被稱為艾滋病相關支原體［1，2］。在其他疾病如抗磷脂抗體綜合征、非淋菌性尿道炎、腫瘤等患者的血液和/(或)分泌物中也逐漸檢到Mpe。IgA腎病是目前國內外最常見的慢性腎小球腎炎，在中國、日本、新加坡等亞太地區，約占原發性腎小球疾病的45% ～50%。在發病20年后，約20%～30%的IgA腎病緩慢進展至慢性腎功能不全，并最終發展為終末期腎病［3］。因此，探討IgA腎病的發病及進展因素有重要意義。有研究發現IgA腎病患者血液和尿液中Mpe感染率明顯增高［4］。本研究采用流式細胞術，檢測IgA腎病患者外周血 CD4+、CD8+、CD3+細胞的水平，比較 IgA腎病患者Mpe感染組和非Mpe感染組各細胞的水平，探討Mpe感染對IgA腎病患者T細胞亞群的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究分兩組IgA腎病組、正常對照組，IgA腎病組根據有無Mpe感染又分為Mpe感染組19例和非Mpe感染組83例(除外同時有其他支原體感染16例)。IgA腎病組:選取2009年1月至2010年6月期間，在溫州醫學院附屬第一醫院腎內科經腎活檢確診的原發性IgA腎病患者，共118例，年齡＞18歲，除外繼發性疾病所致IgA腎病;選取同期在本院體檢者86例為正常對照組(除外支原體感染)。兩組患者還需滿足以下標準:①近7 d內未應用抗菌藥。②近1年內未接受免疫抑制治療;或接受免疫抑制治療，但療程不足1個月。

1.2 血液標本的留取和處理 取研究對象清晨空腹靜脈血2 ml，肝素抗凝，采用流式細胞術測定 CD3+、CD4+、CD8+細胞，試劑盒為BD MultitestTMIMK Kit，購自美國BD公司。流式細胞儀為FACSCalibur，購于BD公司。流式細胞術由本院醫學科學研究所檢測。用促凝管采集清晨空腹靜脈血4 ml，4000rpm離心15 min，分離血清2 ml，12000rpm 離心15 min，棄上清，沉淀用于提取支原體DNA。

1.3 Mpe及支原體檢測

1.3.1 Mpe培養 采用改良SP-4培養基培養，0.2 ml的菌株接種于1.8 ml培養基中，37℃ 5%CO2孵箱培養。支原體培養成功后，抽取2 ml菌液用于支原體DNA提取，采用全式金基因組提取試劑盒進行DNA提取，具體操作按說明書進行。

1.3.2 支原體檢測 用支原體種屬通用的16s rRNA基因擴增支原體Genus片段，陽性提示支原體感染，陽性標本應用Mpe P35脂蛋白基因擴增Mpe目的片段(引物序列見表1)，操作按PCR試劑盒(TOYOBO公司)說明書進行。Southern blot法進一步證實Mpe感染。

2 結果

2.1 一般臨床資料 IgA腎病組:118例患者，男64例，女54例，男女比:1.2∶1，平均年齡(40.84±6.35)歲。正常對照組:86例，男45例，女41例，男女比:1.05∶1，平均年齡為(40.65±6.98)歲。兩組之間比較:性別和年齡差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 穿通支原體檢測結果與試驗分組 正常對照組，86例Genus和Mpe P35均陰性。IgA腎病組:35例Genus陽性(陽性率29.6%)，19例Mpe P35陽性(陽性率16%)。

根據Genus和Mpe P35檢測結果，將IgA腎病組分為Mpe感染組和非Mpe感染組，Mpe感染組納入Mpe P35陽性19例。非Mpe感染組納入Mpe和Genus均陰性83例。

2.3 IgA腎病患者T細胞亞群的變化 IgA腎病組患者外周血中CD3+、CD4+和CD8+T細胞比例較正常對照組明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，而CD4+/CD8+比值較正常對照組明顯減低，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表1 支原體PCR檢測引物

表2 IgA腎病患者T細胞亞群的變化

2.4 Mpe感染對IgA腎病患者T細胞亞群的影響 Mpe感染組和非Mpe感染組患者外周血中CD3+、CD4+和CD8+T細胞水平較正常對照組高，差異有統計學意義(P＜0.05)，而CD4+/CD8+比值較正常對照組減低，差異有統計學意義(P＜0.05)。與非Mpe感染組相比Mpe感染組患者外周血CD3+、CD4+細胞水平及CD4+/CD8+比值減低，差異有統計學意義(P＜0.05)，兩組間CD8+細胞水平比較差異有統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 穿通支原體感染對IgA腎病患者T細胞亞群的影響

3 討論

目前已知Mpe可增強HIV的致病性，加速艾滋病進程。同時研究發現Mpe也參與了如腫瘤的形成、轉移等多種疾病過程［5，6］。研究發現IgA腎病患者血液和尿液中Mpe檢出明顯高于正常人群，提示Mpe感染可能參與了IgA腎病的發病。Mpe感染是通過何種機制參與IgA腎病的過程，尚不明確。

本研究采用流式細胞術，檢測 IgA腎病患者外周血CD4+、CD8+、CD3+細胞的水平，并比較Mpe感染組和非 Mpe感染組各細胞的水平，探討Mpe感染對IgA腎病患者T細胞亞群的影響，結果發現IgA腎病患者與正常對照組相比，CD3+、CD4+和CD8+細胞水平明顯升高，CD4+/CD8+比例減低，Mpe感染后，IgA腎病患者外周血中CD3+、CD4+細胞升高程度有所緩解，CD4+/CD8+比值進一步降低。

目前認為IgA腎病是一種免疫復合物病，已知Th細胞亞群失調參與了IgA腎病的發病。主要表現為Th2功能亢進及其細胞因子(IL24與IL25)生成增多、Th1細胞因子(IFN2 g與IL22)相對不足使IgA分泌IgA增加，且致IgA糖基化異常，從而參與了IgA腎病的發生發展［7］。本研究發現IgA腎病組患者外周血中CD4+、CD8+、CD3+細胞的水平較正常對照明顯升高，提示IgA腎病不但存在Th細胞亞群失調，還存在者其他淋巴細胞亞群失調。沈穎等也采用流式細胞術檢測了IgA腎病患者外周血中CD3+、CD4+和CD8+的表達，發現與正常人相比，CD3無明顯變化，CD4明顯降低，CD8升高，CD4+/CD8+比值顯著減小［8］。雖然 CD3+和 CD4+細胞比例與我們的結果不一致，但是CD4/CD8比值與我們的研究結果一致。因此，CD4+和CD8+細胞亞群失調參與了IgA腎病的病程。

本研究發現Mpe感染組較非感染Mpe組CD3+和CD4+細胞比例的升高有所緩解，Mpe感染后IgA腎病這種T細胞亞群失調反而有輕微改善。本研究結果恰好可以解釋我們原來的研究發現的:Mpe感染組較非Mpe感染組IgA腎病患者臨床表現輕，多表現為發作性肉眼血尿，且病理嚴重程度分級較輕。目前無Mpe感染機體后機體T細胞亞群的改變的研究，但有研究觀察到其他支原體感染如肺炎支原體后T細胞亞群失調，且多表現為CD3+和CD4+細胞比例減低，支持了本研究結果。

Mpe和其他致病性支原體類似，具有特殊的尖端結構，能吸附并穿入細胞，在細胞內增殖、形成空泡，導致細胞死亡。Mpe可黏附和入侵RBC、CD4+T細胞和巨噬細胞，活化NF-κB，促進 TNF-α、IL-1、IL-6 等炎癥因子釋放，誘導巨噬細胞凋亡。這可能部分解釋本研究中Mpe感染的IgA腎病患者外周血中CD4+細胞水平減低。

［1］ Lo SC，Hayes MM，Wang RY，et al.Newly discovered mycoplasma isolated from patients nfected with HIV. Lancet，1991，338(8780):1415-1418.

［2］ 曹玉璞，葉元康.支原體與支原體病.第1版.人民衛生出版社，2000:151-162.

［3］ Monterim RC，Moum IC，Launay P，et al.Pathogenic sign ificance of IgA receptor interaction s in ISA receptor intemctlons in IgA nephrop athy.Trends Mol Med，2002，8(10):464-468.

［4］ 溫秀姝，周麗萍，王賽芳，等.IgA腎病患者血液、尿液及咽拭子標本中穿通支原體的分離檢出.中國微生態學雜志，2008，20(2):174-177.

［5］ Zhang B，Shih JW，Wear DJ，et al.High-level expression of H-ras and c-myc oncogenes in mycoplasma-mediated malignant cell transformation.Proc Soc Exp Biol Med，1997，214(4):359-366.

［6］ 朱豐村，周麗萍.穿通支原體感染對腫瘤浸潤及轉移的影響.檢驗醫學，2010，25(2):113-117.

［7］ Chintalacharuvu SR，Nagy NU，Sigmund N，et al.T cell cytokines determine the severity of experimental IgA nephropathy by regulating IgA glycosylation.Clin Exp Immunol，2001，126，326-333.

［8］ 沈穎，李豐良，張金黎，等.IgA腎病患者外周血T細胞亞群及Fas/Fasl的表達.中國中西醫結合腎病雜志，2009，10(10):917-918.