結核分支桿菌耐異煙肼分子機制的研究

孫鳳丹 李月龍 韓忠波

異煙肼(INH)作為最主要的一線抗結核藥物之一，對其耐藥性的研究日益受到重視。國外也有報道認為結核分支桿菌耐異煙肼的產生是過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關，與inhA基因突變也有相關性［1］。我們采用采用PCR-單鏈構象多態性分析(PCR-SSCP)方法檢測了95株肺結核患者痰標本臨床分離株，并對47例結核患者痰標本直接進行KatG基因、inhA基因突變檢測，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 95株結核分枝桿菌臨床分離株和47例肺結核患者涂陽痰標本。95株臨床分離株按結核病診斷細菌學規程進行菌種鑒定及藥敏實驗證實為結核分支桿菌，其中51株對異煙肼耐藥，44例對異煙肼敏感。47例肺結核患者涂陽痰標本根據臨床癥狀、涂片結果、胸部X線和培養結果確診，其中18例對異煙肼耐藥，29例對異煙肼敏感。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 用傳統酚/氯仿抽提法提取標本中 DNA［2］。

1.2.2 PCR擴增 采用25ul反應體系，4xdNTPs終濃度為0.2 mm01/l，引物終濃度為0.2 umol/L，擴增程序為94℃變性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸 l min，循環 30 次，最后 72℃延伸l0 min。擴增產物擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳。紫外檢測rPOB出現258bp條帶、KatG出現282bp條帶、rpsL出現267bp條帶即為擴增陽性。

1.2.3 SSCP銀染 PCR擴增陽性的標本進行SSCP檢測，擴增產物加等量甲酰胺變性液95℃變性10 min，立即冰浴5 min，在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，條件為6℃100 V電壓，電泳約2～3 h，電泳結束后.，取凝膠板經硝酸銀染色，觀察結果并照相。

2 結果

2.1 PCR擴增，以結核分支桿菌H37RV為對照，44株藥物敏感株、51株耐INH分離株KatG、inhA基因擴增均為陽性;47例耐INH肺結核患者痰標本中，KatG基因44例擴增陽性、inhA基因40例擴增陽性(見表1)。

2.2 應用PCR-SSCP技術檢測KatG、inhA基因突變結果(見表1、2)。44株藥物敏感株的KatG、inhA基因突變率分別為4.5%、0。51株耐INH分離株中，31株KatG基因發生突變，突變率為60.8%;3株inhA基因發生突變，突變率為5.9%。耐INH肺結核患者痰標本中，基因突變檢測率分別為47.7%、7.5%。

表1 對47例肺結核患者痰標本的檢測結果

表2 對95例臨床分離株的檢測結果

3 討論

近年來，耐藥結核病病情逐年上升，特別是對異煙肼和利福平耐藥的耐多藥結核病(MDR-TB)的增多，是影響結核病化療效果的主要原因。因此，建立一種新的快速，有效的藥敏試驗方法對結核病的早期治療具有重要的意義。有研究表明［3］結核分桿菌耐異煙肼的產生與過氧化氫酶一過氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關，與inhA基因也有相關性。本實驗PCR-SSCP方法得出耐異煙肼時，KatG基因突變率為60.8%、inhA基因突變率為5.9%。表明KatG基因突變是結核分支桿菌耐異煙肼臨床分離株主要的基因突變類型。說明KatG在INH耐藥中起主導作用，但某些菌株的耐INH形成可能與KatG無關。KatG基因突變是INH耐藥性的重要分子機制，inhA基因與INH耐藥性有相關性。

由于有90-95%的耐利福平株同時也耐INH，這樣單獨進行INH的藥物敏感性分析可初步制定細菌的耐藥譜。同時檢測了47例耐INH肺結核患者的痰標本，44例擴增陽性的耐INH痰本KatG基因突變率為47.7%、inhA基因突變率為7.5%，說明應用PCR和PCT-SSCP技術可以簡便、快速直接檢測未經培養的痰標本中結核分支桿菌KatG基因突變，為臨床檢測結核分支桿菌耐異煙肼的耐藥性提供了初步依據。

［1］ Pretorius QS，Van Helden PD，Strge1 F，et al.Matation in Katg gene，Antimicrob，Agents Chenother，1995，39(10):2276.

［2］ 張小剛，何秀云，等.結核分支桿菌耐鏈霉素耐藥基因的檢測.實用醫學雜志，2001，17(10):1006-1007.

［3］ 張宗德，馬與，程紹基，等.異煙肼耐藥與結核分支桿菌KatG基因突變的研究.中華結核和呼吸雜志，1996，19(6):346-349.