米爾貝肟對感染性犬蛔蟲卵作用的試驗研究*

曲明麗,李繼昌

犬蛔蟲是犬體內(nèi)廣泛存在的寄生蟲,也是引起人蛔蟲病的主要原因,在許多國家造成嚴(yán)重的流行病學(xué)問題。兒童和成年人能意外吞食犬蛔蟲卵而感染。犬蛔蟲幼蟲可在人體或動物體內(nèi)長期遷移,發(fā)生內(nèi)臟移行癥和眼蛔蟲病[1]。米爾貝肟(milbemycin oxime)是由日本Sankyo公司于1973年從鏈霉菌屬(Strep to myces hygroscopicus)中分離得到的一類具有廣譜殺蟲活性的十六元大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物[2],為由米爾貝霉素A 3肟和米爾貝霉素A 4肟按2∶8比例組成的混合物[3]。該藥是目前防治犬、貓體內(nèi)外寄生蟲的特效藥,能特效防治惡心絲蟲,高效防治蛔蟲、鉤蟲、原蟲、鞭蟲等體內(nèi)寄生蟲,以及毛囊蟲、疥癬、虱、跳蚤等體外寄生蟲[4]。1997年,我國臺灣地區(qū)推出諾華生產(chǎn)的倍脈心(成分為milbemycin oxime),作為犬貓預(yù)防心絲蟲與腸內(nèi)寄生蟲內(nèi)服藥,是米爾貝肟首次在國內(nèi)應(yīng)用。由于專利限制,從上世紀(jì)八十年代發(fā)現(xiàn)至今,中國大陸一直沒有研究和應(yīng)用,隨著專利到期,米爾貝肟作為一種新型抗體內(nèi)外寄生蟲藥越來越受到重視,為評價該藥對蛔蟲病的防治作用,指導(dǎo)臨床合理用藥,本文進(jìn)行了其對感染性犬蛔蟲卵的作用試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 用于分離犬蛔蟲的犬小腸購自哈爾濱市香坊區(qū)成高子屠宰場,屠宰的犬為本地雜種犬;健康昆明種小鼠,購于黑龍江省腫瘤醫(yī)院實驗動物中心。

1.2 受試藥物 米爾貝肟原料藥,白色結(jié)晶性粉末,含量≥98%,4℃避光保存,由浙江海正藥業(yè)股份有限公司提供,臨用時用二甲基亞砜配制成適當(dāng)濃度的溶液。

1.3 試驗方法

1.3.1 雌性犬蛔蟲成蟲的獲取[5]將幽門和盲腸的瓣膜并夾緊后,把小腸分離并放入盛有pH7.0磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS,37℃)的廣口瓶中保存。縱切小腸,用鑷子取出蛔蟲成蟲,并放入37℃含有1.0%甲醛的pH7.0PBS(FS)中清洗,至少 3次,每次2min。選取14cm左右的雌性犬蛔蟲放在含有2%葡萄糖和1%牛血清的pH7.0PBS中,37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 犬蛔蟲卵的收集[6]將雌性犬蛔蟲每24h轉(zhuǎn)移到一個新培養(yǎng)瓶中,并收集犬蛔蟲卵,直到蟲體衰竭。所獲得的犬蛔蟲卵經(jīng)1500r/min離心5min,清洗后,放入含1.0%甲醛的pH7.0PBS中,29℃溫箱中培養(yǎng)。2周后顯微鏡下觀察犬蛔蟲卵形態(tài),如果犬蛔蟲卵形態(tài)正常并且卵內(nèi)已形成幼蟲,并且卵內(nèi)幼蟲活動,即可判定犬蛔蟲卵已發(fā)育成感染性犬蛔蟲卵。

1.3.3 感染性犬蛔蟲卵的活性測試[7]在正式實驗前,對所獲得的感染性犬蛔蟲卵進(jìn)行活性檢測。將感染性犬蛔蟲卵感染5只小白鼠(1000個/只),感染第7d,解剖小鼠,在90%的小白鼠肺部檢出幼蟲,據(jù)此結(jié)果,判定感染性犬蛔蟲卵具有活性,可用于動物體感染。

1.3.4 不同濃度的藥液與感染性犬蛔蟲卵作用的時間 將感染性犬蛔蟲卵濃縮為1000個/0.5mL。將配好的不同濃度藥液分別與感染性犬蛔蟲卵液混合使其終濃度分別為 10-5、10-6、10-7g/mL,作用時間分別為 12、24、48h。

1.3.5 動物分組及感染 小鼠在潔凈凈化隔離室內(nèi)飼養(yǎng),使用高壓滅菌墊料和購入包裝飼料,飲水無限制。正常飼養(yǎng)1周后,挑取健康者進(jìn)行實驗。將小白鼠分成11組,每組10只。其中9組分別感染與不同藥物濃度作用的感染性犬蛔蟲卵溶液;1組為空白對照組(只灌服有 1.0%甲醛的 pH7.0 PBS),另1組為陽性感染組(只灌服感染性蛔蟲卵)。小鼠感染前均禁食12h,可進(jìn)水。次日晨進(jìn)行灌胃感染,劑量均為每只小鼠1000個卵/0.5mL。在感染后的3d、5d分別進(jìn)行解剖,觀察肺臟的損害情況,并做臟器的病理組織學(xué)觀察。

2 結(jié) 果

2.1 肺臟的肉眼觀察結(jié)果 陽性感染組中的小鼠肺臟出現(xiàn)紅色肝樣變和大面積出血兩種典型的癥狀。藥物實驗組在感染3d后,灌服低濃度藥物(10-7g/mL)作用12h的感染性犬蛔蟲卵的小鼠,其肺臟有很多出血點。但此濃度作用24、48h,小鼠肺臟觀察無病變。灌服高濃度藥物(10-5g/mL)作用12h的感染性犬蛔蟲卵的小鼠,其肺臟觀察正常。在感染5d后,低濃度藥物(10-7g/mL)與感染性犬蛔蟲卵作用時間12h,小鼠的肺臟出血點增多。但作用24h后,小鼠肺臟正常。其它藥物實驗組的小鼠肺臟均無病變。

2.2 肺臟的病理組織學(xué)檢查結(jié)果 小鼠肺臟的病理組織學(xué)變化見圖1(圖1)。陽性感染組(圖1.2),與空白對照組(圖1.1)比較,肺泡腔萎縮,散在大量血細(xì)胞。血管和細(xì)支氣管處有炎細(xì)胞浸潤并伴有紅細(xì)胞。感染3d后,灌服10-7g/mL米爾貝肟作用12h感染性犬蛔蟲卵的小鼠,其肺臟出現(xiàn)明顯病變,即血管和細(xì)支氣管處有炎性細(xì)胞浸潤并伴有紅細(xì)胞(圖1.3);灌服此濃度藥液作用24h、48h感染性犬蛔蟲卵的小鼠,其肺臟的病變輕微,甚至無病變。10-5、10-6g/mL米爾貝肟無論與感染性犬蟲卵作用時間長短,感染其小鼠的肺臟病變輕微,甚至無病變(圖1.4)。

小鼠感染5d后,灌服10-7g/mL藥液作用12h感染性犬蛔蟲卵的小鼠,其肺臟病變嚴(yán)重,即支氣管和肺泡腔內(nèi)有大量血細(xì)胞或嗜酸性深染物質(zhì)(圖1.5)。隨著兩者作用時間的加長(24h、48h),感染其小鼠的肺臟病變減輕,甚至無病變(圖1.6)。

3 討 論

犬蛔蟲卵在犬體內(nèi)會發(fā)生內(nèi)臟幼蟲移癥,即犬直接吞食感染性犬蛔蟲卵,在犬的小腸內(nèi)孵化成幼蟲,幼蟲鉆入腸壁、經(jīng)淋巴系統(tǒng)到腸系膜淋巴結(jié),然后經(jīng)血液到達(dá)肝臟,再隨血液到肺臟,感染后的第5d,肺中的幼蟲到達(dá)高峰,幼蟲經(jīng)肺泡、細(xì)支氣管、支氣管、氣管到達(dá)咽部,再被咽入胃,到小腸后進(jìn)一步發(fā)育為成蟲。蛔蟲幼蟲在犬體內(nèi)移行過程中,損傷腸壁、肺毛細(xì)血管及肺泡壁。

從米爾貝肟對感染性犬蛔蟲卵的體內(nèi)試驗結(jié)果看,無論小鼠感染3d后還是5d后剖檢,也不論藥物與感染性犬蛔蟲卵作用多長時間,肺臟的病變程度都隨著藥物濃度的增高而減弱,說明高濃度(10-5、10-6g/mL)米爾貝肟可明顯影響感染性犬蛔蟲卵對小鼠的感染程度。

小鼠感染3d后,從其剖檢的肺臟來看,同一濃度的藥物與感染性犬蛔蟲卵作用時間越長,肺臟的損害越輕微。這可認(rèn)為藥物與感染性犬蛔蟲卵作用時間越長,感染性犬蛔蟲卵的感染性越弱,從而引起小鼠肺臟病變就越輕微,即藥物與感染性犬蛔蟲卵作用48h,小鼠感染高濃度(10-5、10-6g/mL)藥物作用的感染性犬蛔蟲卵后,其肺臟幾乎正常。低濃度藥物(10-7g/mL)僅引起極輕微的紅色肝樣變。小鼠感染5d后,陽性感染組的小鼠肺臟病變相當(dāng)嚴(yán)重,與用藥組相比較,小鼠肺臟病變輕微。其病變規(guī)律同上。

圖1 小鼠肺臟病理組織學(xué)的變化Fig.1 Histopathologic changes of the lungs ofmice

綜上所述,高藥物濃度(10-5g/m L)無論與感染性犬蛔蟲卵作用多久,都會使感染性犬蛔蟲卵失去感染性,使感染性犬蛔蟲卵無法移行到肺臟,對肺臟造成損害。低藥物濃度(10-7g/m L)雖不能完全抑制感染性犬蛔蟲卵的活性,但與陽性對照比較,也能致使部分感染性犬蛔蟲卵失活,以致肺臟損傷不嚴(yán)重。當(dāng)藥物濃度為10-6g/m L時,與感染性犬蛔蟲卵作用24h后,即可達(dá)到高濃度(10-5g/m L)藥物同樣的效果。所以,米爾貝肟對感染性犬蛔蟲卵有很好的滅活作用。

[1]Kerr-Muir MG.Toxocara canis and human health[J].BMJ 1994,309:5-6.

[2]Takiguchi Y,Mishima H,Okuda M.A new family ofmacrolide antibodies:fermentation,isolation and physico-chemical properties[J].JAntibiot,1980,33:1120-1127.

[3]Bater AK.Efficacy of oralmilbemy cin against natu rally acquired heartwormin fection in dogs[C].Proceedings of the Heartworm Symposium'89,Charleston,South Carolina,1989:17-19.

[4]Mckellar Q A,Ben chaoui H A.Aver mectins and milbemycins[J].Jou rnal of Veterinary Pharmcology and Therapeutics.1996,19:331-351.

[5]Ponce-Macotela M,Peralta-AbarcaGE,Martnez-Gordillo MN.Giardia intestinalisand other zoonotic parasites:prevalence in adult dogs from the sou thern part of Mexico City[J].Vet Parasitol.2005,131:1 4.

[6]Caballero A R,Luna-Ochoa R I,Ponce-Macotela M,et al.A simple and inexpensive in vitro method for retrieving fertilized Toxocara canis eggs[J].Parasitol Res,2007,101:829 832.

[7]邱琳.兩種基因型蛔蟲在小鼠體內(nèi)的移行和分布[D].南昌大學(xué)碩士學(xué)位論文,2007:12.