非培養技術解析生化系統微生物群落結構

崔 迪，李 昂，王繼華，張 斯，龐長瀧，馬 放，王 立，崔 瀟

(1.哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，150090 哈爾濱，jscz－dd@hotmail.com;2.哈爾濱工業大學市政環境工程學院，150090 哈爾濱;3.哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，150025 哈爾濱)

非培養技術解析生化系統微生物群落結構

崔 迪1，2，李 昂1，2，王繼華3，張 斯1，2，龐長瀧1，2，馬 放1，2，王 立1，2，崔 瀟1，2

(1.哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，150090 哈爾濱，jscz－dd@hotmail.com;2.哈爾濱工業大學市政環境工程學院，150090 哈爾濱;3.哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，150025 哈爾濱)

為揭示城市污水廠生化系統穩定運行階段微生物與污染物降解效率間的關系，采用變性梯度凝膠電泳(PCR－DGGE)和Biolog技術，對冬春季城市污水廠穩定運行階段生化系統中的微生物群落結構及代謝活性進行動態監測.結果顯示，冬春季生化系統出水水質指標COD、NH4+－N和TN的平均去除率分別達84.4%、84.7%和59.8%左右.同季生化系統中不同位點微生物群落結構穩定，以芽孢桿菌 (Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、氣單胞菌(Aeromonas)為主的優勢菌群生態位穩定;春季溫度升高，生化系統中微生物種群數量、多樣性及代謝活性均加強，利于污染物的有效去除.

生化系統;微生物群落;變性梯度凝膠電泳;Biolog;代謝活性

活性污泥法因其投資少、無二次污染等優點廣泛應用于城市污水處理廠，但由于生化處理系統主體是微生物而存在一定的不可預測和不可控性［1－5］，因此，城市污水處理廠穩定運行期生化系統內部微生物的生存狀態是亟待解決的主要問題之一.傳統的生物學研究方法已經無法滿足對微生物進行實時跟蹤監測的要求，而微生物非培養技術［6］的應用可以彌補傳統方法的不足.其中變性梯度凝膠電泳 (Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)與Biolog兩種技術近年來已廣泛應用于土壤、水體污染［7－9］等環境領域微生物空間變化的研究中.

本文主要采用PCR－DGGE技術，跟蹤監測某城市污水處理廠生化系統中微生物季節性的演替規律，同時應用簡便、快速的 Biolog技術［10－12］考察生化系統中微生物對不同碳源的代謝活性及多樣性.對兩種方法在揭示城市污水廠生化系統穩定運行階段微生物與污染物降解效率間關系的可行性進行深入探討，為研究低溫生境生化系統中高效降解微生物間的關系提供理論依據和技術支撐.

1 試驗

1.1 工藝概述

針對北方地區特有的低溫生態條件，處理工藝為A/O活性污泥法［13］，設計進出水水質見表1，出水執行《城鎮污水處理廠污染物排放標準》(GB18918—2002)二級標準［14］.

表1 污水廠設計進出水水質 mg·L－1

1.2 樣品采集及DNA提取

分別于冬季11月和春季4月采集生化系統前段及末段活性污泥樣品，各150～200 mL，離心收集，保存于－80℃.

微生物DNA的提取采用試劑盒(上海華舜生物技術有限公司)方法，吸光度OD260/OD280比值均在1.62～1.72，所得基因組DNA片斷較為完整，純度較好，滿足后續PCR擴增模板要求.

1.3 PCR－DGGE及聚類分析

PCR 反應體系(50 μL):100 ng模板、20 pmol GC338F 和 518R 引物［15］各 0.5 μL、200 μmol/L dNTPs(每種 10 mmol/L)4 μL、10 × PCR buffer(MgCl2)5 μL、2.5 U 的 Pfu DNA 聚合酶1 μL，無菌純水補齊到50 μL.

PCR反應條件:94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55 ℃ 退火 40 s，72 ℃ 延伸 40 s，30 個循環，72℃最終延伸8 min.PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

采用Bio－Rad公司DcodeTM的基因突變檢測系統對PCR反應產物進行分離.使用梯度混合裝置，制備6% ～12%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度從30%到60%(100%的變性劑為7 mol/L的尿素和40%的去離子甲酰胺的混合物).

電泳條件:溫度設定為60℃，150 V的電壓下，電泳時間6 h，獲得凝膠銀染后，經 Image ScannerⅢ掃描儀掃描.圖譜聚類分析采用UPGAMA算法.

1.4 Biolog活性分析

1.4.1 Biolog Eco板接種液制備［16］

1)將采集的活性污泥樣品沉淀30 min后，取1 mL污泥到1.5 mL離心管中;

2)10 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加1 mL生理鹽水，在振蕩器上振動5 min混勻，于10 000 r/min離心1 min以去除大的顆粒物質;

3)取上清液倒入裝有無菌生理鹽水 (NaCl，0.85%)的試管中，OD590取定值;

4)將上述稀釋液加入 Biolog生態微孔板(Biolog Eco－ Plate，美國 Biolog公司)(150 μL/孔)中，避光保濕培養，每隔一定時間用細菌自動讀數儀在590 nm下讀取數據，連續測定至孔板內吸光度無明顯變化為止［17］.

1.4.2 微生物群落多樣性分析

由于采用不同培養時間的數據計算會產生不同的結果，對各生物相的平均吸光度值與時間變化曲線相關聯進行分析，采用培養60 h的數據計算微生物群落的多樣性指數［18－20］.

1)微生物代謝強度采用平均吸光度，計算公式為

式中:AC為反應孔的吸光度值;AR為對照孔的吸光度值.

2)微生物群落多樣性采用Shannon指數H表示，即

式中:Pi=ni/N，其中ni為峰面積，N為所有峰的總面積.

2 結果分析

2.1 冬春季生化系統穩定運行期水質指標

如圖1(a)、(b)和(c)所示，城市污水處理廠生化處理系統冬春季運行水溫維持在11～18℃，進水COD、NH4+－N及TN指標相對穩定.出水COD去除率平均達84.4%，NH4+－N去除率平均達84.7%，TN平均去除率達59.8%.冬季，生化系統對NH4+－N的去除效率隨水溫下降而降低;春季，生化系統對NH4+－N的去除效率隨水溫升高而上升.春季生化系統能夠保持對NH+4－N轉化效率是由于部分硝化及亞硝化細菌能夠適應水體溫度而發生硝化反應;冬季水溫的降低使得生化系統中部分硝化及亞硝化細菌無法適應低溫條件而減少了硝化反應的發生，致使NH+4－N去除效率降低［25］.圖1(b)顯示水溫維持在12～13℃階段，生化系統保持較高的NH4+－N轉化率，驗證了部分可轉化N元素的耐冷菌群發揮脫氮作用，維持了低溫生化系統的穩定運行.

圖1 冬春季生化系統出水水質特征(2007.11—2008.4)

2.2 冬春季生化系統微生物群落結構變化及聚類分析

2.2.1 冬春兩季生化系統微生物群落結構演替

由圖2可見，Lane1，Lane3分別有29和24條帶;Lane2，Lane4分別有38和39條帶.特征優勢條帶一直存在系統中，代表生化系統中常駐優勢菌群的存在，經測序鑒定主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)等，其中芽孢桿菌作為主要絮凝菌群對提高生化系統活性污泥的沉降性能起到積極作用［21］;部分菌群優勢信號隨外界溫度的變化而逐漸加強或減弱，如生絲微菌屬(Hyphomicrobiaceae)，其轉化 N元素的能力對生化系統提升脫氮效率具有積極作用［22］，可能為圖1(b)低溫(12～13℃)時期生化系統保持較高NH4+－N轉化率的適低溫功能微生物群落之一.

Lane1，Lane2 和 Lane3，Lane4 分別代表不同季節生化系統相同位點微生物群落結構，春季溫度升高利于生化系統中微生物的生長，部分適中溫微生物開始富集生長，少量適冷微生物(如Band A，Band B所代表的微生物群落)逐漸消失.

Lane1，Lane3 和 Lane2，Lane4 分別代表相同季節生化系統不同位點微生物群落結構，溫度不變，各位點的微生物群落結構維持穩定，種群數量改變較小，這是維持生化系統出水水質達標的原因之一［21，23］.

圖2 冬春季總細菌DGGE圖譜

2.2.2 冬春兩季生化系統微生物群落聚類分析

圖3顯示相同季節各生化系統微生物群落結構的相似性高于不同季節的微生物群落結構相似性，微生物群落結構呈現出穩定演替的趨勢.Lane1與Lane3相似性達72%以上;Lane1與Lane2相似性達65%，相似性發生變化而降解效率穩定，可能是由于部分適低溫微生物在春季被中溫微生物替代或缺失，如部分硝化細菌及亞硝化細菌在低溫(＜10℃)生境中無法存活［25］，而生化系統中大部分具有高效降解能力的微生物其功能并沒有隨數量變化而改變.整體來講，春季微生物種群數量好于冬季，同時穩定的群落結構保證了群落的功能穩定，從而保持生化系統污染物的有效去除.

圖3 DGGE圖譜UPMGA聚類分析

2.3 微生物群落代謝強度及多樣性分析

2.3.1 微生物群落代謝強度變化分析

Biolog公司生產的Eco－PlateTM是按照微生物對3大營養物質糖類、脂類、氨基酸類及其相應衍生物劃分原則設計出的31種碳源，AWCD指數反映了微生物菌群對31種碳源總體的利用程度［24］.根據AWCD結果生成的曲線圖符合微生物生長曲線規律(如圖4所示)，含有潛伏期、指數期及穩定期，但衰亡期因監測時間較短而無法體現［20］.

圖4 平均吸光度隨時間的變化

兩組曲線擬合度較好，顯示出生化系統不同位點的微生物群落在相同季節對所有碳源的利用程度相似;穩定期曲線持續時間較長，說明冬春季生化系統中微生物能夠較好適應生境變化，維持穩定的代謝活性，這與圖2生化系統微生物群落結構穩定相符合.同時，春季生化系統中部分中溫微生物群落隨著溫度的回升而呈倍數增殖［25］，強化了生化系統原有微生物代謝活性的強度，因此，春季生化系統對碳源的利用程度高于冬季.

2.3.2 微生物群落多樣性分析

冬春季生化系統中Shannon多樣性指數 (圖5)變化幅度維持在0.118～0.203，微生物多樣性好且物種豐富;而不同季節微生物群落多樣性有差別，春季好于冬季，這是由于溫度回升使得中溫微生物恢復倍數增殖導致生化系統中的微生物在數量、活性及多樣性上都發生了改變，這與圖2所顯示的微生物群落演替規律相一致.

圖5 不同季節微生物群落Shannon多樣性指數

3 結論

1)冬春季大部分能夠高效去除COD、轉化NH4+－N及去除TN的微生物可穩定作用于生化系統，使得冬春季出水COD平均去除率維持在84.4%左右，NH4+－N平均轉化率維持在84.7%左右，TN平均去除率維持在59.8%左右，出水水質符合《城鎮污水處理廠污染物排放標準》(GB18918—2002)二級標準.

2)以芽孢桿菌、假單胞菌、氣單胞菌為優勢菌群的生化系統中微生物群落結構穩定，不同季節微生物群落結構演替規律明顯，春季微生物多樣性及代謝活性高于冬季.

3)通過PCR－DGGE及Biolog兩種方法驗證了冬春季生化系統出水COD、NH4+－N及TN的去除率與轉化率主要受微生物多樣性及代謝活性的影響，兩種方法結合監測低溫城市污水廠生化系統中微生物動態變化是可行的.

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Analysis of microbial community structure of biochemical system using uncultured technology

CUI Di1，2，LI Ang1，2，WANG Ji-hua3，ZHANG Si1，2，PANG Chang-long1，2，MA Fang1，2，WANG Li1，2，CUI Xiao1，2

(1.State Key Lab of Urban Water Resource and Environment，150090 Harbin，China，jscz－dd@hotmail.com;2.School of Municipal and Environmental Engineering，Harbin Institute of Technology，150090 Harbin，China;3.School of Life Science and Technology，Harbin Normal University，150025 Harbin，China)

To reveal the relationship between microorganism and pollutants’degradation in the stability system of the municipal wastewater treatment plant，the dynamic monitoring of microbial community structure and metabolic activity of the stable operation biological system in biological wastewater treatment plant was carried out using the denaturing gradient gel electrophoresis(PCR －DGGE)and Biolog Technology.The results showed that the average removal efficiency of effluent COD，NH4+－N and TN was more than 84.4%，84.7%and 59.8%，respectively.The microbial community structure was stable in the different sites of biological system in the same season，and the ecological niche of predominant functional species including Bacillus，Pseudomonas，Aeromonas was stable.As the temperature increased in spring，the quantity and diversity of population increased significantly.Meanwhile，metabolic activity strengthened in bioloical system，which could improve the removal rates of pollutants.It is feasible to use the two methods to monitor the changes of microbial community structure of biological system in a wastewater treatment plant at low temperature.

biological system;microbial community;PCR－DGGE;Biolog;metabolic activity

X703.1

A

0367－6234(2011)10－0045－05

2010－05－15.

國家自然科學基金資助項目(51108120，51178139，51108145，50809020);國家水體污染控制與治理科技重大專項基金資助項目(2008ZX07313－001);中國博士后科學基金資助項目(20090460901);哈爾濱市科技局青年科技創新人才研究專項基金資助項目(2011RFQXS093).

崔 迪(1984—)，女，博士研究生;

馬 放(1963—)，男，教授，博士生導師.

(編輯 劉 彤)