含人Fc重組凋亡融合蛋白體內外抗腫瘤活性初步研究

羅嵐，劉洪洪，李祥，范開

1995年Wiley 等[1]利用表達序列標簽（EST）的方法在人心肌細胞 cDNA 文庫中鑒定出腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族凋亡誘導分子的一個新成員——腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL），TRAIL 通過與其相關受體結合，可誘導細胞發生凋亡。與 TNF 家族的另外 2 種凋亡誘導分子（TNF-α、Fas-L）相比，TRAIL 具有如下特點：①持續地表達于大多數正常細胞中，具有強大誘導腫瘤細胞凋亡的能力，且對正常細胞基本無影響；②比 Fas-L 具有更廣的抗癌譜；③對核因子NF-κB 僅有很微弱的激活作用，即使是全身用藥，也不會產生類似 TNF-α 的嚴重炎癥反應。因此，TRAIL 被認為是一種更為安全且極具潛力的抗腫瘤蛋白[2]。

TRAIL 重組蛋白主要利用大腸桿菌以包涵體形式表達，經復性、純化后得到含 Zn2+的三聚體活性結構。目前，TRAIL 重組蛋白已進入臨床研究階段，美國 Amgen/gentech 公司研發的 TRAIL 重組蛋白產品已進入 II 期臨床試驗階段，在國內相同 TRAIL 重組蛋白產品也已進入 I、II 期臨床試驗階段，研究結果顯示 TRAIL 重組蛋白聯合化療的抗腫瘤療效明顯，但半衰期較短[3]。為了進一步證實其作用，我們對 CHO 真核表達系統制備的含人抗體 Fc 片段的 TRAIL（TRAIL-Fc）重組融合蛋白在體內外的抗腫瘤活性進行了初步評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 TRAIL-Fc 重組融合蛋白凍干粉，1 mg/支，純度 95%，由 CHO 真核表達系統表達制備，其中人 IgG 抗體 Fc 片段位于重組融合蛋白的 C 端，TRAIL 蛋白位于其 N 端，購自重慶富進生物醫藥有限公司；TRAIL 對照品凍干粉，1 mg/支，純度 95%，由大腸桿菌表達制備，購自深圳新鵬生物工程有限公司；5-氟尿嘧啶注射液（5-Fu），10 ml/0.25 g，購自上海旭東海普藥業有限公司；RPMI-1640、DMEM 培養基和胎牛血清購自美國 Hyclone 公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自上海生工生物工程技術服務有限公司；其余試劑均為國產分析純。Spectra MAX 190 全波長酶標儀為美國Dynex公司產品。

1.1.2 細胞株 人急性 T 淋巴細胞白血病Jurkat 懸浮細胞、人結腸癌 LOVO 貼壁細胞、人胃癌 MKN45 貼壁細胞、人表皮癌 A431 貼壁細胞、人肝癌 HEPG2 貼壁細胞、人乳腺癌 MCF-7貼壁細胞均購自上海細胞庫和武漢大學中國典型培養物保藏中心，由重慶富進生物醫藥有限公司傳代保存。其中 Jurkat 細胞培養于含 10%胎牛血清、100 μg/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素的RPMI-1640 完全培養液中，其余細胞均培養于含10%胎牛血清、100 μg/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素的 DMEM 完全培養液中，置于 37℃、5%CO2的孵箱中培養。

小鼠肝癌 H22 懸浮細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心，培養于含 10%胎牛血清、100 μg/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素的 RPMI-1640 完全培養液中，置于37℃、5%CO2的孵箱中培養。

1.1.3 實驗動物 雄性 BALB/C 小鼠 40 只，6～8 周齡，體重（20±2）g，購自重慶醫科大學動物實驗中心[合格證號：SYXK（渝）2002007]，飼養于重慶醫科大學實驗中心 SPF 級動物房。

1.2 方法

1.2.1 體外抗腫瘤活性 采用 MTT 法檢測。調整 Jurkat 懸浮細胞、H22 懸浮細胞的密度為1×105個/ml，其余 5 種貼壁細胞 LOVO、MKN45、A431、HEPG2、MCF-7 分別用 0.25%的胰蛋白酶消化后，調整細胞密度為5×104個/ml。實驗分TRAIL-Fc 重組融合蛋白組、對照組和空白對照組，每組各設 2 個復孔。將細胞均接種于 96 孔板中（100 μl 孔），置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，分別加入含 1000、250、62.5、15.6、3.9、0.97 ng/ml TRAIL-Fc 重組融合蛋白和 TRAIL 對照品的完全培養液各 100 μl，同時以加入 100 μl 完全培養液作為空白對照組。各組細胞經不同處理后繼續培養 24 h，每孔加入 10 μl 濃度為5 mg/ml的 MTT，繼續培養 4 h 后，貼壁細胞直接吸棄培養上清液，懸浮細胞離心后吸棄培養上清液，每孔加入 100 μl 的 DMSO，微量振蕩儀振蕩 5min，在 Spectra MAX 190 全波長酶標儀上測定各孔于波長 570 nm 處的吸光度（A570）值，按下列公式計算細胞生長抑制率：生長抑制率（%）=（1 － 實驗孔A570/對照孔A570）×100%，并繪制細胞生長抑制率曲線，計算半數抑制濃度（IC50）。

1.2.2 體內抗腫瘤活性 選取 H22 細胞分別行腹腔和腋下接種建立小鼠肝癌模型。調整 H22 懸浮細胞密度為1×107個/ml，0.3 ml/只接種于BALB/C 小鼠腹腔內，10 d 后抽取小鼠腹水，調整細胞密度為1×107個/ml，再分別對小鼠進行腹腔和腋下接種。待接種 3 d 后，據治療藥物的不同將小鼠隨機分為空白對照組、5-Fu 組和 TRAIL-Fc重組融合蛋白組，每組 6 只，給藥途徑均為腹腔內注射。其中空白對照組每只每天注射生理鹽水0.3 ml，5-Fu 組每只每天注射劑量為25 mg/kg，TRAIL-Fc 重組融合蛋白組每只每 3 天的注射劑量為10 mg/kg。

給藥后每天測量并記錄腹腔接種腫瘤小鼠的腹圍和體重，接種后第5 天開始每天測量腋下接種腫瘤小鼠的腫瘤體積，腫瘤體積（TV）的計算公式為TV（mm3）= 1/2×a×b2，其中 a、b 分別表示腫瘤的長徑和短徑。接種后第15 天結束實驗，摘除眼球取外周血后處死各組小鼠，剝取瘤塊稱重，計算抑瘤率，計算公式為抑瘤率（%）=（1 －實驗組平均瘤重/空白對照組平均瘤重）×100%。收集各組小鼠外周血，經離心后獲取血清，送至重慶市九龍坡區第一人民醫院檢測血清中 AST 及ALT 含量，觀察肝臟功能損傷情況。

2 結果

2.1 TRAIL-Fc 重組融合蛋白的體外抗腫瘤活性

以250 ng/ml TRAIL-Fc 重組融合蛋白處理腫瘤細胞 6～8 h 后，鏡下觀察顯示 7 種細胞均出現脫落變圓、胞質皺縮、體積縮小等凋亡表現（圖1）。

對 7 種腫瘤細胞株的體外生長抑制作用實驗結果表明，分別加入不同濃度的 TRAIL-Fc 重組融合蛋白后，所有腫瘤細胞生長均受到不同程度的抑制作用，且抑制作用呈劑量依賴效應（圖2）。其中對 MCF-7 細胞的抑制作用最強，其最大生長抑制率為82.5%；其次依次為LOVO、MKN45、H22、Jurkat、HEPG2 細胞，其最大生長抑制率分別為81.9%、52.3%、51.2%、50.9%、35.4%；而對 A431細胞的抑制作用最弱，其最大生長抑制率為20.3%。

TRAIL-Fc 重組融合蛋白對 7 種腫瘤細胞的半數抑制濃度（IC50）結果顯示，與 TRAIL 對照品相比，TRAIL-Fc 重組融合蛋白對 LOVO、MKN45、MCF-7 細胞更敏感（表1）。

圖1 250 ng/ml TRAIL-Fc 重組融合蛋白體外作用 8 h 后LOVO 細胞的形態學觀察 相差顯微鏡×100（A：TRAIL-Fc 重組融合蛋白組；B：空白對照組）Figure 1 Morphology of LOVO cells treated by 250 ng/ml TRAIL-Fc recombinant fusion protein for 8 h in vitro (Phasecontrast microscopemicroscopy, original magnification×100)(A: TRAIL-Fc recombinant fusion protein group; B: Blank control group)

圖2 MTT 法檢測 TRAIL-Fc 重組融合蛋白對 7 種腫瘤細胞的體外生長抑制作用（A：MKN45 細胞；B：LOVO 細胞；C：MCF-7 細胞；D：HEPG2 細胞；E：Jurkat 細胞；F：A431 細胞；G：H22 細胞）Figure 2 The growth inhibition effect of TRAIL-Fc recombinant fusion protein on 7 kinds of tumor cell lines by MTT method in vitro.A: MKN45 cells; B:LOVO cells; C: MCF-7 cells; D: HEPG2 cells; E: Jurkat cells; F: A431 cells;G: H22 cells.

2.2 TRAIL-Fc 重組融合蛋白的體內抗腫瘤活性

接種 H22 細胞建立小鼠肝癌模型進行體內抗腫瘤活性實驗的結果顯示，腹腔接種 10 d 后，空白對照組小鼠腹水增加，腹部明顯膨出；TRAIL-Fc重組融合蛋白組小鼠腹部僅輕微膨脹；5-Fu 組小鼠極度消瘦，腹部無膨脹。自給藥后每天測量各組小鼠體重，其中 TRAIL-Fc 重組融合蛋白組小鼠體重維持較好，未見明顯變化；空白對照組小鼠后期體重略有下降；5-Fu 組小鼠體重急劇下降（圖3A、表2）。

表1 TRAIL-Fc 重組融合蛋白對 7 種腫瘤細胞體外生長抑制的敏感性Table 1 The sensitivities of TRAIL-Fc recombinant fusion protein to 7 kinds of tumor cell lines growth inhibition in vitro

圖3 H22 細胞荷瘤小鼠分別注射生理鹽水、5-Fu 和TRAIL-Fc 重組融合蛋白后的體重變化和腫瘤體積生長曲線（A：腹腔接種后各組小鼠的體重變化曲線；B：腋下接種后各組小鼠的腫瘤體積生長曲線）Figure 3 The curves of tumor volume and body weight of H22 celles tumor-bearing mice injected by normal saline, 5-Fu,or TRAIL-Fc recombinant fusion protein respectively.A: The curves of body weight of mice injected H22 celles into abdominal; B: The curves of tumor volume of mice injected H22 celles into armpit.

圖4 接種 15 d 后 H22 細胞腋下荷瘤小鼠瘤塊（每組 6 只）Figure 4 The tumor of mice injected H22 cells into armpit after 15-day (6 mice in each group)

H22 細胞腋下荷瘤小鼠，接種 5 d 后每天測量腫瘤體積，其中 5-Fu 組腫瘤體積明顯縮小，TRAIL-Fc 重組融合蛋白組腫瘤體積后期略有增加，空白對照組腫瘤體積持續顯著增加（圖3B）。接種 15 d 后結束實驗，剝取各組小鼠瘤塊稱重并計算抑瘤率，其中 TRAIL-Fc 重組融合蛋白組抑瘤率為45.79%，5-Fu 組小鼠未見瘤塊（圖4、表2）；取小鼠血清進行 AST 和 ALT 檢測，結果顯示 TRAIL-Fc 重組融合蛋白對小鼠肝功能無明顯影響（表3）。

表2 接種 15 d 后 H22 細胞荷瘤小鼠的體重和瘤重（±s）Table 2 The body weight and tumor weight of H22 celles tumor-bearing mice after 15-day injection (±s )

表2 接種 15 d 后 H22 細胞荷瘤小鼠的體重和瘤重（±s）Table 2 The body weight and tumor weight of H22 celles tumor-bearing mice after 15-day injection (±s )

小鼠體重（g） Body weight of mice (g)組別Groups 實驗前 Before experiment 實驗后 After experiment瘤重（g）Tumor weight (g)空白對照組 Blank control group 18.18±1.08 17.33±1.42 3.21±0.61 5-Fu 組 5-Fu group 17.92±1.81 12.21±1.16 0 TRAIL-Fc 重組融合蛋白組 TRAIL-Fc recombinant fusion protein group 17.64±0.69 16.48±1.62 1.74±0.46

表3 接種 15 d 后 TRAIL-Fc 重組融合蛋白對 H22 細胞荷瘤小鼠肝功能的影響（±s）Table 3 The effect of TRAIL-Fc recombinant fusion protein on H22 celles tumor-bearing mice liver function after 15-day injection (±s )

表3 接種 15 d 后 TRAIL-Fc 重組融合蛋白對 H22 細胞荷瘤小鼠肝功能的影響（±s）Table 3 The effect of TRAIL-Fc recombinant fusion protein on H22 celles tumor-bearing mice liver function after 15-day injection (±s )

組別Groups AST (U/L) ALT (U/L)空白對照組Blank control group 16.00±1.84 7.00±0.42 5-Fu 組5-Fu group 38.00±6.01 47.00±5.73 TRAIL-Fc 重組融合蛋白組TRAIL-Fc recombinant fusion protein group 22.00±4.36 11.00±1.45

3 討論

TRAIL因具有廣泛誘導腫瘤細胞凋亡作用而對正常細胞基本無毒性的特點，而有望成為一種既有效又安全的腫瘤治療藥物。但已有報道 TRAIL對正常肝細胞有殺傷作用，如在體外大劑量 TRAIL重組蛋白（如 His-TRAIL[4]、用抗體鉸鏈的 FLAGTRAIL[5]）對新鮮分離的人原初肝細胞有毒性，而天然 TRAIL 對正常人肝細胞則無毒性[6]，這將有可能限制 TRAIL 重組蛋白的抗腫瘤臨床應用。

與大腸桿菌表達的 TRAIL 重組蛋白相比，通過 CHO 真核表達系統表達制備的 TRAIL-Fc 重組融合蛋白具有更多的優勢，如無需蛋白復性、具有天然 TRAIL 構象、附有糖基化修飾等。同時通過與抗體 Fc 片段融合后其體內半衰期延長，減少了 TRAIL 可能帶來的肝細胞毒性。此外，由抗體Fc 片段介導的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用（ADCC）還可增強 TRAIL 的體內抗腫瘤作用。

在本研究中，體外抗腫瘤活性實驗結果表明，TRAIL-Fc 重組融合蛋白具有較強的抑制腫瘤細胞生長的能力。分別加入不同濃度的 TRAIL-Fc 重組融合蛋白后，所有腫瘤細胞生長均受到不同程度的抑制作用，且抑制作用呈劑量依賴效應，其中抑制作用最強的是 MCF-7 細胞和 LOVO 細胞；并且所有細胞均出現脫落變圓、胞質皺縮、體積縮小等凋亡表現，初步證實了該蛋白是通過誘導細胞凋亡的方式從而抑制腫瘤細胞生長。體內抗腫瘤活性實驗結果表明，以每 3 天 1 次的給藥頻率，TRAIL-Fc重組融合蛋白能夠有效抑制小鼠腹腔及腋下荷瘤細胞的生長。由此可推斷，通過與抗體 Fc 片段融合后，TRAIL 在體內的半衰期明顯延長。但有關TRAIL-Fc 重組融合蛋白抑制腫瘤細胞生長與凋亡的具體作用機制，及其體內最低有效劑量和半衰期等問題，還有待進一步研究。

[1]Wiley SR, Schooley K, Smolak PJ, et al.Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis.Immunity, 1995, 3(6):673-682.

[2]Fan XG.T cells express TRAIL receptors.Immunol J, 2000, 16(4):316.(in Chinese)范學工.TRAIL受體的T細胞表達.免疫學雜志, 2000, 16(4):316.

[3]Yee L, Fanale M, Dimick K, et al.A phase IB safety and pharmacokinetic (PK) study of recombinant human Apo2L/TRAIL in combination with rituximab in patients with low-grade non-Hodgkin lymphoma.J Clini Oncolo, 2007, 25(18):8078.

[4]Pitti RM, Marsters SA, Ruppert S, et al.Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family.J Biol Chem, 1996, 271(22):12687-12690.

[5]Schneider P.Production of recombinant TRAIL and TRAIL receptor:Fc chimeric proteins.Methods Enzymol, 2000, 322:325-345.

[6]Ganten TM, Koschny R, Sykora J, et al.Preclinical differentiation between apparently safe and potentially hepatotoxic applications of TRAIL either alone or in combination with chemotherapeutic drugs.Clin Cancer Res, 2006, 12(8):2640-2646.