湘蕾金銀花提取物對馬鈴薯多酚氧化酶活性的影響

羅文娟，曾彪，田仁軍，龍桂友，彭國平

馬鈴薯是一種重要的經濟作物，但馬鈴薯的多酚氧化酶（PPO）催化生成一系列色素物引起的褐變現象一直制約著馬鈴薯的開發利用[1-3]。金銀花（Lonicera japonicaThunb.）中含有綠原酸、異綠原酸、木犀草素等不飽和化合物，其中的酚羥基結構極易與自由基反應，故具有顯著的抗氧化特性[4]。本文通過研究不同提取方法的金銀花提取物對馬鈴薯多酚氧化酶活性的影響，探尋馬鈴薯多酚氧化酶的天然抑制劑，為馬鈴薯深加工過程中防止褐變提供新的思路和參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 湘蕾金銀花干品，產自湖南省隆回縣小沙江金銀花基地，經 50℃干燥 48 h，粉碎至 40 目；馬鈴薯，市售。

1.1.2 試劑 無水乙醇購自湖南匯虹試劑有限公司，分析純。

1.1.3 儀器 UV-2100 雙光束紫外-可見分光光度為北京瑞利分析儀器有限公司產品；RE-52AA 旋轉蒸發儀為上海亞榮生化儀器廠產品；高速冷凍離心機 CR21G 為日本日立公司產品。

1.2 方法

1.2.1 湘蕾金銀花提取物的制備

1.2.1.1 水提法：精確稱取 5.0 g 湘蕾金銀花粉末置圓底燒瓶中，加入 50 ml 蒸餾水回流提取 1 h。過濾后，濾渣再用 50 ml 蒸餾水提取 0.5 h，過濾，合并兩次濾液，減壓濃縮至流膏狀。用 10 ml 熱蒸餾水洗出，4500×g離心10min，上清液定容至 20 ml，配制成含生藥 0.25 g/ml 的湘蕾金銀花水提物溶液，備用。

1.2.1.2 醇提法：以 70%乙醇為溶劑按照 1.2.1.1 法回流提取，配制成含生藥 0.25 g/ml 的湘蕾金銀花醇提物溶液，備用。

1.2.1.3 醇水結合提取法：將湘蕾金銀花曬干品粉末 5.0 g用 95%乙醇提取 1 h 后，濾渣再用 50 ml 蒸餾水提取0.5 h，過濾，合并兩次濾液，減壓濃縮至流膏狀。用 10 ml熱蒸餾水洗出，4500×g離心 10min，上清液定容至20 ml，配制成含生藥 0.25 g/ml 的湘蕾金銀花醇水結合提取物溶液，備用。

1.2.2 馬鈴薯多酚氧化酶（PPO）的提取 將 4℃下冷藏的馬鈴薯去皮，取塊莖 100 g，加 100 ml 經 4℃預冷的磷酸緩沖液（pH 6.8），用組織勻漿機打成勻漿。4 層紗布過濾，濾液 5600×g高速冷凍離心 10min，取上清液用蒸餾水定容至 50 ml，得馬鈴薯 PPO 粗酶液，置冰水浴中保存，備用[5]。

1.2.3 多酚氧化酶（PPO）活性檢測 將 pH 6.8 磷酸緩沖液、 0.2 mol/L 鄰苯二酚及 PPO 液在 30℃的水浴中預保溫，在比色皿中依次加入 2.0 ml 的磷酸緩沖液、0.3 ml 的酶液、0.5 ml 濃度為0.2 mol/L 的鄰苯二酚溶液（空白對照為2.5 ml 的磷酸緩沖液、0.3 ml 的酶液），用 UV-2100 雙光束紫外可見分光光度計在 410 nm 處比色，每 2 秒計數一次，測得 1min 內的 PPO 酶活動力學特征曲線圖。

1.2.4 不同劑量的金銀花提取物對 PPO 動力學影響的研究 在 1.2.3 中的反應組和空白對照組中分別加入 0、10、15、20、25、30 μl 金銀花的 3 種提取物，按照上述測定方法，每 2 秒計數一次，記錄各時刻的 OD 值，將在相同時刻測得兩個 OD 值相減，以時間為橫軸，OD 差值為縱軸作圖，得金銀花提取物對 PPO 活性影響的動力學特征曲線。規定一個酶活力單位（U）定義為：在測定條件下，單位時間內引起吸光度改變 0.001 所需的酶量。以最初 10 s內直線段的斜率（△OD/0.001 t）求酶活力。

1.3 統計學處理

用 SPSS13.0 統計軟件對實驗數據進行分析，以P＜0.05 為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

2 結果

2.1 湘蕾金銀花提取物對 PPO 酶促反應動力學的影響

三種湘蕾金銀花提取物對 PPO 活性影響的動力學曲線（圖1～3）表明：多酚氧化酶氧化鄰苯二酚的反應和產物的生成速度初始較快，隨著反應時間的延長，PPO 的活性逐漸降低，這是由于生成的醌類物質使多酚氧化酶活性受到抑制的結果，即存在反饋抑制作用。圖1 表明反應體系中金銀花水提物對 PPO 酶活抑制作用存在劑量效應；圖2表明不同劑量的金銀花醇提物對 PPO 酶活抑制效果差異不明顯；圖3 表明金銀花醇水結合提取物對 PPO 酶活抑制作用明顯，30 μl 醇水結合提取物對酶活抑制作用最強。

圖1 湘蕾金銀花水提物對 PPO 活性影響的動力學曲線

圖2 湘蕾金銀花醇提物對 PPO 活性影響的動力學曲線

圖3 湘蕾金銀花醇水結合提取物對 PPO 活性影響的動力學曲線

2.2 不同提取方法的湘蕾金銀花提取物對 PPO 活性影響的比較

SPSS統計分析結果（表1）表明，三種提取物對 PPO活性存在明顯抑制作用；三種提取方法獲得的提取物對PPO 活性抑制作用差異不顯著（P＞ 0.05）；水提取物和醇水混合提取物對 PPO活性抑制作用存在劑量效應（P＜0.01），而醇提物對 PPO 活性抑制作用無劑量效應（P＞0.05）。

表1 不同劑量的湘蕾金銀花 3 種提取物對 PPO 酶活抑制作用的影響

3 討論

本試驗研究結果表明：湘蕾金銀花水提物、70%乙醇提取物、95%乙醇和水結合提取物對 PPO 活性均存在抑制作用，表明湘蕾金銀花含有多種 PPO 抑制成分，抑制強弱表明以水溶物中的 PPO 抑制劑較多，在 70%乙醇提取物中含量相對較少，根據筆者對湘蕾金銀花活性成分的提取經驗，70%乙醇提取組分多是黃酮類，95%乙醇與水提取的混合組分中成分較復雜，對 PPO 活性具有抑制作用的成分還有待進一步探究。

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