靶向Tak1基因的siRNA干擾對小鼠腹腔巨噬細胞的生物學效應

王欽富，李坤，李志，徐娜，董敏，韓慧

轉化生長因子 β 激活激酶（transforming growth factor-β-activating kinase 1，Tak1）為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在功能與序列上與絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogen—activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK）相關，屬于 MAPKKKs 家族成員。眾多研究表明 Tak1 介導的信號轉導通路參與了炎癥（如膿毒癥）、免疫反應、細胞凋亡和纖維化疾病等病理生理過程以及細胞周期調控與細胞分化等過程，因而 Tak1 參與調控的信號通路與人類疾病的關系日益受到普遍關注。Tak1 基因在 T、B 免疫細胞中起到非常重要的作用，但在髓樣細胞中的作用尚未見報道。本文利用 siRNA 技術使小鼠腹腔巨噬細胞 Tak1 基因沉默并觀察其生物學效應，初步探討 Tak1 基因在髓樣細胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明純種小鼠（No：SCXK2002-0002），II 級，體重 18～22 g，購自大連醫科大學動物中心。靶向Tak1 基因的 siRNA（正義鏈 5’ GCUCAUGCCAU GAGCUGGUGUUUAC 3’，反義鏈 5’ GUAAACAC CAGCUCAUGGCAUGAGC 3’，MSS218539）、Trizol總 RNA 抽提試劑、逆轉錄試劑盒 Super Strip III為美國Invitrogen 公司產品；IL-1β ELISA檢測試劑盒為美國 R&D 公司產品；NucleofectorTM試劑為德國 Amaxa 公司產品。巨噬細胞培養液：DMEM 培養液，加 10%胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺（使終濃度為2mmol/L）。無水乙醇、氯仿、異丙醇均為國產分析純；焦碳酸二乙酯（DEPC）為美國 Sigma 公司產品。Prism 7700 PCR儀為美國 ABI 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細胞培養 取昆明純種小鼠，腹腔注射 4%巰基乙醇酸鈉（thioglycolate）1～2 ml，3～5 d 后行麻醉、脫頸致死，用巨噬細胞培養液灌洗腹腔，吸出培養液，放入無菌平皿鋪板 3～5 h，吸棄上清，用培養液洗滌 1 次，備用。

1.2.2 siRNA 基因沉默的最佳轉染濃度和時間的優化 備用小鼠腹腔巨噬細胞 100 g，洗滌 5min，取 1.5×106個巨噬細胞加 100 μl Nucleofactor 溶液，分別加入 0.6、1.2、1.6 μmol/L Tak1 siRNA，混勻，并設立空白對照。移入電轉杯（勿產生氣泡），放置電轉儀，實施轉染。然后移入預溫的培養板中培養，24 h 后收集細胞，Trizol reagent 法提取總RNA，進行熒光定量 PCR，檢測 Tak1 mRNA 表達。Tak1 引物序列：正義鏈 5’ ATTCCACAGATAC CAATGGCTC 3’；反義鏈 5’ TGTAGTAACAATGC GATTTCGG 3’。RNA 濃度和純度檢測，按常規方法操作。按照 Super Strip III 試劑盒說明書進行RT-PCR，同時設計出內參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的引物（序列：正義鏈 5’ AGGGCATCT TGGGCTACAC 3’；反義鏈 5’ TGGTCCAGGGTTT CTTACTCC 3’），在檢測 Tak1 基因 mRNA 的同時對每個樣品中 GAPDH 的表達進行檢測，以校正不同樣品之間因 RNA 總量、質量及逆轉錄反應效率差異所導致的目的基因的表達差異。取 5 μl cDNA進行熒光定量 PCR。循環條件：94℃預變性 3min，94℃變性 45 s，55℃退火 45 s，共進行 40 個循環。

1.2.3 Western blotting 技術檢測蛋白表達 小鼠腹腔巨噬細胞 100 g，洗滌 5min，取 1.5×106個巨噬細胞加 100 μl Nucleofactor 溶液，分別加入0.6、1.2、1.6 μmol Tak1 siRNA，并設立空白對照，轉染后接種 24 孔板，密度 6×105個/ml，每孔500 μl。siRNA 轉染后 48 h 進行細胞總蛋白提取，BCA 法進行蛋白質定量。各組樣本均取總蛋白質15 μg 上樣，經 100 g/L 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)后轉 PVDF 膜。與兔抗小鼠 Tak1多克隆一抗 4℃孵育過夜。與 HRP 標記的羊抗兔 IgG 抗體室溫孵育 1 h 后，ECL 顯色，暗室中觀察，膠片曝光記錄結果。同時用 β-actin 作為內參確證蛋白上樣量一致。

1.2.4 siRNA 轉染對巨噬細胞分泌細胞因子水平的影響 小鼠腹腔巨噬細胞按前述方法加入1.6 μmol Tak1 siRNA，并設立空白對照，轉染后接種 48 孔板，密度 6×105個/ml，每孔 250 μl。轉染后 24 h 加入 100 ng/ml 脂多糖（LPS），24 h 后收集上清，ELISA 法檢測 IL-1β 表達水平。設立3 個平行孔，實驗重復三次取平均值。

1.3 統計學處理

用 SPSS 11.0 統計學軟件進行分析，多個樣本均數間的數據采用單因素方差分析，兩樣本比較采用配對資料t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 siRNA 基因沉默的最佳轉染濃度

細胞轉染 Tak1 siRNA，設立空白對照，轉染24 h 后收集細胞檢測 mRNA 水平（圖1）。實驗結果顯示各組抑制率分別為69.73%、80.85%、88.78%。不同濃度 siRNA 與空白對照組比較有統計學差異（P＜0.01）。

圖1 小鼠腹腔巨噬細胞轉染后 Tak1 mRNA 表達水平Figure 1 Tak1 mRNA level of Tak1 siRNA transfected mouse peritoneal macrophage

2.2 siRNA 轉染后 Tak1 基因蛋白的變化

細胞轉染 Tak1 siRNA，設立空白對照，轉染48 h 收集細胞，用 Western blotting 法檢測 Tak1蛋白表達。各濃度 Tak1 siRNA 轉染后 48 h Tak1蛋白表達明顯減弱。β-actin 各組無差異（圖2）。

圖2 Tak1 siRNA 下調正常小鼠腹腔巨噬細胞結果Figure 2 Tak1 expression of Tak1 siRNA transfected normal mouse peritoneal macrophage

圖3 Tak1 siRNA 轉染對巨噬細胞分泌細胞因子 IL-1β水平的影響Figure 3 IL-1β secretion of Tak1 siRNA transfected macrophage

2.3 siRNA轉染對巨噬細胞分泌細胞因子水平的影響

小鼠腹腔巨噬細胞轉染 Tak1 siRNA，濃度1.6 μmol/L，設立空白對照，轉染 24 h加入 LPS，24 h 后收集培養細胞上清進行 IL-1β 表達水平檢測（圖3）。轉染組 IL-1β 表達水平為（248.7±66.3）pg/ml，顯著高于對照組（41.1±7.9）pg/ml（P＜0.01）。

3 討論

Tak1 在天然免疫和獲得性免疫中起著關鍵作用。Sato 等[1]采用 cre-loxp 技術條件性敲除 B 細胞中 Tak1 基因，證實 Tak1 在B細胞 NF-κB 活化及 JNK 活化中不可或缺。隨后 Sato 等[2]又構建Tak1 缺失 T 細胞小鼠，證實 Tak1 在 TCR 介導NF-κB 活化及 MAPKs（mitogen-activated protein kinase）活化，以及 T 細胞成熟、增殖中的關鍵作用。Wan 等[3]也證實 Tak1 在 T 細胞發生、增殖、成熟中的作用， Tak1 缺失 T 細胞小鼠胸腺細胞發育，特別是 Treg 細胞發育減少，NF-κB 活性及JNK 活性降低。Liu 等[4]也報道了類似結果。Tang等[5]利用 Mx1Cre 小鼠和 Tak1fx/fx小鼠交配得到Mx1Cre＋Tak1fx/fx小鼠，誘導產生 Tak1 基因敲除小鼠，研究 Tak1 基因對血細胞生成的影響，結果表現為骨髓和肝損傷，血細胞生成減少，凋亡增加。

本文通過 siRNA 干擾技術，研究沉默 Tak1基因的表達。結果表明 siRNA 可以有效抑制 Tak1 mRNA 及蛋白的表達，抑制率可達到 88.78%。哺乳動物細胞中可能缺少產生持續性 RNA 干擾效應的能力，所以細胞進行 2～4 次分裂后 RNA 干擾效應一般會消失[6]。此外，siRNA 容易被普遍存在的 RNA 酶降解，只能維持較短時間的基因沉默作用。在本研究中 siRNA 轉染小鼠腹腔巨噬細胞后，Tak1 基因 mRNA 水平在 48 h 達到抑制，Tak1 基因蛋白實現沉默效應，因此，我們選擇在24 h 對小鼠腹腔巨噬細胞受 LPS 刺激細胞因子IL-1β 分泌水平進行檢測，結果反映出 Tak1 基因在髓樣細胞中呈負性調控作用。我們實驗觀察到Tak1 基因在髓樣細胞被沉默后，并沒有抑制 LPS激活TLR 信號通路，炎性細胞因子 IL-1β 反而升高，說明髓樣細胞 Tak1 基因調控炎性因子的產生存在復雜機制。

維持和調控機體免疫應答對機體是非常關鍵的，正常的免疫應答對機體能夠抵抗感染，而過度的免疫應答會對機體產生損害。揭示 Tak1 基因在髓樣細胞中的不同于 T、B 細胞的作用規律，對深入了解免疫系統的調控網絡具有重要的意義，可能為其分子靶點治療提供新的視角。

[1]Sato S, Sanjo H, Takeda K, et al.Essential function for the kinase Tak1 in innate and adaptive immune responses.Nat Immunol, 2005,6(11):1087-1095.

[2]Sato S, Sanjo H, Tsujimura T, et al.Tak1 is indispensable for development of T cells and prevention of colitis by the generation of regulatory T cells.Int Immunol, 2006, 18(10):1405-1411.

[3]Wan YY, Chi H, Xie M, et al.The kinase Tak1 integrates antigen and cytokine receptor signaling for T cell development, survival and function.Nat Immunol, 2006, 7(8):851-858.

[4]Liu HH, Xie M, Schneider MD, et al.Essential role of TAK1 in thymocyte development and activation.Proc Natl Acad Sci U S A,2006, 103(31):11677-11682.

[5]Tang M, Wei XD, Guo YS, et al.Tak1 is required for the survival of hematopoietic cells and hepatocytes in mice.J Exp Med, 2008, 205(7):1611-1619.

[6]Stein P, Svoboda P, Anger M, et al.RNAi: mammalian oocytes do it without RNA-dependent RNA polymerase.RNA, 2003, 9(2):187-192.