重組質粒 pUDK-PmL-IR-GM 的體內免疫激活作用

楊月峰，王華，肖鳳君，徐潔，李慶芳，嚴俊，王立生

我國前列腺癌（prostate cancer，PC）的發病率呈現逐年上升趨勢，悄悄影響著老年人口的生活質量和預期壽命[1-2]。PC 的發病與機體免疫抑制或耐受相關，包括特異性和非特異性免疫被阻斷[3]。而抗原遞呈功能不足是導致腫瘤患者免疫抑制狀態的最重要因素，以致即使產生效應細胞，也很難識別和殺死腫瘤細胞[4]。樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是已知體內功能最強、唯一能活化靜息 T 細胞的專職抗原提呈細胞，是啟動、調控和維持免疫應答的中心環節。目前，通過多種策略制備的 DC疫苗取得了令人鼓舞的結果[5-7]。

CD40-CD40L 是特異性免疫反應系統的一對重要共刺激分子。研究表明，CD40L 與腫瘤抗原融合表達，能通過 CD40L 的靶向作用將腫瘤抗原帶到 DC 表面，進而激活機體特異性抗腫瘤免疫反應[8]。而粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）能有效促進 DC 的成熟和分化[9]。本研究將構建攜帶融合蛋白基因 PSA-IZ-mCD40L（PmL）和 GM-CSF基因的重組質粒載體 pUDK-PmL-IR-GM，并探討其小鼠體內免疫激活作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康二級 Balb/c 雄性小鼠20 只，4～6 周齡，體重：（21.32±2.19）g。由軍事醫學科學院醫學動物中心提供，合格證號：SCXK-（軍）2007-004，飼養于軍事醫學科學院 SPF級動物房。

1.1.2 質粒、菌株和細胞 pUDK 為本實驗室自行設計并構建的基因治療質粒載體；pUDK-HmLIR-GM 為攜帶乙肝病毒（HBV）抗原多肽、mCD40L融合蛋白基因和 GM-CSF 基因的質粒載體；pUDK-mL-IR-GM 為攜帶 mCD40L 和 GM-CSF 基因的質粒載體；TE-SV-IR-TP-55K 為攜帶人源 GM-CSF（hGM-CSF）基因的 T 載體，以上質粒載體均由本實驗室保存。DH5a 感受態細胞購自北京博大泰克；人 PC 細胞系 LNCaP 購自北京協和細胞庫；人肝癌細胞系 HepG2 為本實驗室保存。

1.1.3 工具酶及主要試劑 限制性內切酶 ApaI、KpnI、EcoRV、BglII、EcoRI、NotI 和 XbaI，λ-HindIII Marker 購自日本 TaKaRa 公司；高保真 DNA 聚合酶 KOD-Plus 試劑盒購自日本 TOYOBO 公司；T4 DNA 連接酶購自美國 NEB 公司；cDNA 第一鏈合成試劑盒 M-MLV、脂質體 2000、D2000 Marker、質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒購自北京 TIANGen 公司；ConA、MTT、RPMI1640 和 DMEM 培養基購自美國 Sigma 公司；FBS 購自美國 Hyclone 公司和北京元亨圣馬生物技術研究所；G418 購自德國 Merck 公司；流式檢測抗體 PE-anti-CD3、FITC-anti-CD4、APC-anti-CD8 和 PE-anti-B220 購自美國 Biolegend 公司；人 GM-CSF ELISA 檢測試劑盒購自北京晶美公司；Trizol 試劑購自美國 Invitrogen 公司；細胞殺傷檢測試劑盒 CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay 購自美國 Promega 公司；羊抗鼠 CD40L 抗體購自美國 R&D 公司，兔抗山羊二抗購自北京中杉公司；引物合成及測序均由北京奧科生物技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 前列腺特異性抗原與 mCD40L 的融合蛋白基因 PmL 的克隆 采用 Trizol 法提取人前列腺癌細胞 LNCaP 和小鼠 T 淋巴細胞的 RNA，分別采用 M-MLV 反轉錄試劑盒合成 cDNA，并以其為模板，PCR 分別擴增前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）基因和鼠源性CD40 配體（mouse CD40 ligand，mCD40L）基因。擴增條件為：95℃預變性 2min；95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，68℃延伸 1min，30 個循環；68℃延伸 10min；22℃1min。同時，采用基因合成的方法合成含有異亮氨酸拉鏈（isoleucine zipper，IZ）的連接序列 linker，具體為：將引物IZ1-IZ6 混合后，取 1.0 μl 作為模板，采用重疊PCR 的方法，先擴增 10 個循環，再分別加入 0.5 μl引物 IZ1 和引物 IZ6，繼續擴增 20 個循環，擴增條件同上。所需引物如表1 所示。

表1 PSA-IZ-mCD40L 融合蛋白基因的相關引物Table 1 Primers for construction of fusion protein gene PSA-IZ-mCD40L

將得到的基因片段 PSA、linker、mCD40L 割膠回收純化后，將其按照摩爾比 1∶3∶1 混合，在不加引物條件下擴增 10 個循環。然后加入 PSA上游引物和 mCD40L 下游引物，PCR 擴增全長融合蛋白基因 PmL（PSA-IZ-mCD40L）。擴增條件為：95℃預變性 2min；95℃變性 30 s，60℃退火30 s，68℃延伸 2min，30 個循環；68℃延伸10min；22℃1min。

1.2.2 重組質粒 pUDK-PmL-IR-GM 的構建 以TE-SV-IR-TP-55K 為模板，PCR 擴增獲取目的基因 hGM-CSF（上游：5’ CCCAGCGGCCGCGGATG TGGCTGCAGAGCCTGCTG 3’；下游：5’ GCCGTC TAGATCACTCCTGGACTGGCTCCCA 3’；擴增條件：95℃預變性 2min；95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，68℃延伸 30 s，30 個循環；68℃延伸10min；22℃1min）。質粒載體 pUDK 與 GMCSF 基因分別進行 NotI 和 XbaI 雙酶切后，T4 DNA 連接酶于 24℃連接 2 h，轉化 DH5α 感受態細胞，Kana+ LB 平板篩選陽性克隆 pUDK-GM，并經酶切鑒定正確。

融合蛋白基因 PmL 進行 KpnI 和 EcoRI 雙酶切后，克隆到 pUDK-GM 的相應位點，Kana+ 篩選陽性克隆 pUDK-PmL-GM。NotI 和 EcoRI 雙酶切 pUDK-HmL-IR-GM 獲取核糖體內部進入位點（internal ribosome entry sites，IRES）基因，并將其克隆到 pUDK-PmL-GM 的相應位點，Kana+ 篩選陽性克隆 pUDK-PmL-IR-GM，經酶切鑒定正確后，測序鑒定正確。

對于廣大網球運動員的專項體能訓練，應確保他們訓練內容與實際比賽需求相吻合，必須要結合具體訓練目標，只有這樣，才能真正發揮出專項體能訓練的積極作用。假設專項體能訓練內容與實際網球比賽規定相違背，將會直接并且嚴重地影響運動員的比賽成績。例如，在實施耐力方面的訓練時，應盡可能確保在網球訓練場地、有球拍和球的狀況下進行，這樣能夠加強集體訓練項目與網球運動員真實技術水平之間的緊密性，同時還能讓運動員感受到真實比賽的氛圍。在日常專項體能訓練中，應讓網球運動員體會到真實比賽中所需的強度、力度以及節奏，這將能夠充分鍛煉運動員臨場發揮的能力。

1.2.3 重組質粒 pUDK-PmL-IR-GM 的鑒定 采用脂質體介導的方式將重組質粒 pUDK-PmL-IRGM、對照質粒 pUDK-mL-IR-GM 和 pUDK- EGFP轉染 HEK293 細胞；并采用 G418 篩選獲得穩定表達細胞株。分別收集穩定轉染細胞的培養上清，并采用 ELISA 檢測試劑盒檢測 GM-CSF 的表達；同時，提取細胞蛋白，采用羊抗鼠 CD40L 抗體檢測目的蛋白 PmL 和 mCD40L 的表達。

1.2.4 動物分組、給藥方式及免疫細胞分離 將小鼠隨機分為PBS 組、pUDK 組、pUDK-PmL-IRGM 組和 pUDK-mL-IR-GM 組，每組 5 只。分別于第1、11、21 和 35 天進行免疫，每次給予 50 μg質粒/200 μl，PBS 組給予 200 μl PBS，分別于小鼠右側后腿肌肉分點注射。

小鼠脾臟是重要的免疫器官，含有豐富的免疫細胞，包括 T 淋巴細胞和 B 淋巴細胞，而尼龍毛能夠有效吸附 B 淋巴細胞。末次免疫后 10 d 處死小鼠，尼龍毛法分離小鼠脾臟 T 淋巴細胞。具體為：于超凈臺取小鼠脾臟組織研磨，收集細胞后裂解紅細胞，并重懸于 5%FBS 的 1640 培養基中，將其加入到尼龍毛柱（已用 5%FBS 的 1640 培養基平衡）中，室溫靜置 30min 后，讓液體自然流出并洗滌，收集流出液和洗滌液中的細胞，即可得到小鼠 T 淋巴細胞。

1.2.5 小鼠 T 淋巴細胞免疫功能分析 為檢測T 淋巴細胞的純度及融合蛋白對小鼠 T 淋巴細胞的激活作用，一組細胞標記 PE-anti-B220 抗體；另一組細胞同時標記 PE-anti-CD3 抗體，FITC-anti-CD4 抗體 和 APC-anti-CD8 抗體。然后，流式細胞分別檢測 B、T 淋巴細胞的含量，CD4+T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞的含量及比值的改變。

將分離得到的小鼠脾臟 T 淋巴細胞以 3×104個細胞/孔接種于 96 孔板，然后分別采用conA（陽性對照組），培養基（陰性對照組）和LNCaP 細胞培養上清（實驗組）進行刺激，培養 4 d后，MTT 法檢測各組 T 淋巴細胞的增殖能力。

分離得到的小鼠 T 淋巴細胞，用 LNCaP 細胞培養上清孵育 4 d 后，采用 CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay 試劑盒分別檢測其在不同的效靶比情況下，對 LNCaP 細胞和 HepG2細胞的特異性殺傷作用。

1.3 統計學分析

應用 SAS 8.2 統計學軟件進行數據處理。定量資料以±s表示，整體比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗，均以P＜0.05 為差異有統計學意義，P＜0.01 為有顯著統計學差異。

2 結果

2.1 質粒載體 pUDK-PmL-IR-GM 的構建

圖1 重組質粒 pUDK-PmL-IR-GM 的構建Figure 1 Construction of recombinant plamid pUDK-PmLIR-GM

圖2 重組質粒 pUDK-PmL-IR-GM 結構示意圖Figure 2 Diagram of recombinant plamid PUDK-PmL-IRGM

然后，分步將目的基因 hGM-CSF、PmL、IRES依次克隆到相應位點，分別得到中間載體 pUDKGM 和 pUDK-PmL-GM，并最終成功篩選獲得目的載體 pUDK-PmL-IR-GM，經酶切鑒定正確后，測序鑒定正確（圖1B 和圖2）。

2.2 質粒載體 pUDK-PmL-IR-GM 蛋白表達水平鑒定

為檢測在穩定轉染條件下目的蛋白的表達情況，將 pUDK-PmL-IR-GM、對照質粒 pUDK-mLIR-GM 以及 pUDK-EGFP 分別以脂質體方式轉染HEK293 細胞后，G418 篩選，14 d 后得到穩定轉染的細胞株，其中 pUDK-EGFP 轉染的細胞，其綠色熒光蛋白的表達效率達到 95%以上。

分別提取穩定轉染細胞的蛋白和培養上清，采用 Western blot 和 ELISA 檢測目的蛋白 PmL（或mL）和 GM-CSF 的表達。結果顯示，pUDK-PmLIR-GM 和 pUDK-mL-IR-GM 轉染的細胞，能夠表達與羊抗鼠 CD40L 抗體結合的蛋白，其大小分別為50 kD 和 35 kD 左右。ELISA 檢測結果顯示，pUDK-PmL-IR-GM 和 pUDK-mL-IR-GM 轉染的細胞培養上清中含有大量的 GM-CSF。上述結果表明，目的載體 pUDK-PmL-IR-GM 能夠在細胞水平有效表達融合蛋白 PmL 和 GM-CSF（圖3）。

圖3 pUDK-PmL-IR-GM 的蛋白水平鑒定Figure 2 Identification of the protein expressed by pUDKPmL-IR-GM

2.3 小鼠 T 淋巴細胞的分離及純度鑒定

小鼠末次免疫后 10 d，處死小鼠，并采用尼龍毛柱去除 B 淋巴細胞，得到純度較高的 T 淋巴細胞。流式檢測結果顯示，B 淋巴細胞的含量在 10%左右，而 CD3+T 淋巴細胞的含量均高于 80%，符合進一步功能實驗的要求（圖4）。

圖4 流式細胞術檢測分離得到細胞的純度（A：B 淋巴細胞；B：T 淋巴細胞）Figure 4 Purity of cells isolated from the spleen of mice (A: B lymphocytes; B: T lymphocytes)

2.4 pUDK-PmL-IR-GM 免疫對小鼠 T 淋巴細胞功能的影響

為評價 pUDK-PmL-IR-GM 對小鼠 T 淋巴細胞的激活作用，分別對 T 淋巴細胞亞群的改變、T 淋巴細胞增殖能力及 PC 細胞的特異性殺傷作用進行檢測。

圖5 流式細胞術檢測小鼠脾臟 T 淋巴細胞亞群（A：T 淋巴細胞亞群含量；B：T 淋巴細亞群比值，*與 PBS 組相比，P＜0.05）Figure 5 Assay subtypes of T lymphocytes by flow cytometry (A: Percentage of T lymphocyte subsets; B: The ratio of T lymphocyte subsets, *Compared with the PBS group,P＜0.05)

2.4.1 對 T 淋巴細胞亞群的影響 CD4+T 淋巴細胞比例升高以及 CD4+T/CD8+T 值升高是機體免疫激活的重要標志。分離得到的脾臟 T 淋巴細胞分別標記 PE-anti-CD3，FITC-anti-CD4 和 APC-anti-CD8 后，流式細胞術檢測結果顯示，pUDKPmL-IR-GM 免疫后，小鼠 CD4+T 淋巴細胞的比例有升高的趨勢；而 CD4+T/CD8+T 值明顯升高，且與對照組相比，具有統計學差異（P＜0.05）（圖5）。結果表明，pUDK-PmL-IR-GM 免疫后，小鼠處于一定的免疫激活狀態。

2.4.2 對 T 淋巴細胞增殖能力的影響 T 淋巴細胞增殖，是機體應對外源刺激產生免疫應答的重要環節。將分離得到的脾臟 T 淋巴細胞與含有PSA 抗原的 LNCaP 細胞培養上清共同孵育，MTT檢測其增殖能力。結果顯示，PSA 抗原刺激能夠明顯增強 pUDK-PmL-IR-GM 組 T 淋巴細胞的增殖能力（P＜0.05）；而且，PSA 抗原作用后，pUDKPmL-IR-GM 組 T 淋巴細胞的增殖能力明顯高于PBS、pUDK 以及 pUDK-mL-IR-GM 組，且具有統計學差異（P＜0.05）（圖6）。上述結果表明，pUDK-PmL-IR-GM 免疫可增強小鼠 T 淋巴細胞應對 PSA 的特異性增殖作用。

圖6 MTT 法檢測小鼠 T 淋巴細胞的增殖（a與陰性對照相比，P＜0.01；b與 PBS 免疫小鼠的 PSA 上清組比，P＜0.01；c與 pUDK 免疫小鼠的 PSA 上清組比，P＜0.01；d與pUDK-mL-IR-GM 免疫小鼠的 PSA 上清組比，P＜0.01）Figure 6 Assay proliferation ability of T lymphocytes from mice by MTT (aCompared with the negative control,P＜0.01;bCompared with the cells from PBS group which stimulated by PSA,P＜0.01; cCompared with the cells from pUDK group which stimulated by PSA,P＜0.01; dCompared with the cells from PUDK-mL-IR-GM group which stimulated by PSA,P＜0.01)

圖7 小鼠 T 淋巴細胞對 LNCaP 細胞的殺傷效應（*與pUDK 免疫組相比，P＜0.05）Figure 7 Assay effect of LNCap cells killed by T lymphocytes from mice (*Compared with the pUDK group,P＜0.05)

2.4.3 對 T 淋巴細胞特異性殺傷作用的影響 小鼠脾臟 T 淋巴細胞與 PSA 抗原共孵育 4 d，使其進一步激活后，以其作為效應細胞，檢測其對LNCaP 細胞和 HepG2 細胞的特異性殺傷作用。結果顯示，在效靶比為5∶1 時，pUDK-PmL-IR-GM免疫小鼠的 T 淋巴細胞對 LNCaP 的殺傷效率能夠達到 25%以上，明顯高于對照組，且與 pUDK免疫組相比，具有統計學差異（P＜0.05）（圖7）；同時，在不同效靶比條件下，其對肝癌細胞 HepG2沒有明顯的殺傷作用。表明免疫后小鼠的 T 淋巴細胞具有一定的特異性殺傷效應。

3 討論

前列腺癌的發病與機體的免疫功能障礙相關，包括 NK、T 淋巴細胞和 DC 細胞的活化被阻斷等。目前認為，前列腺癌逃避免疫的機制與腫瘤細胞表面分子[包括主要組織相容性復合體（MHC）I 類分子、腫瘤抗原、共刺激分子等]的缺失相關，腫瘤細胞分泌的可溶性抗原能夠中和機體產生的抗體。此外，一些免疫抑制相關細胞因子的分泌，使得腫瘤局部或全身抗腫瘤免疫反應受到抑制[3]。

作為特異性免疫反應系統的一對重要共刺激分子，CD40-CD40L 在 T 細胞活化以及效應性細胞因子的分泌過程中起著重要調節作用。近年來，CD40L 在腫瘤基因治療的應用研究不斷深入。研究表明，CD40L 導入對胰腺癌、惡性黑色素瘤、轉移性肝癌、肺癌以及卵巢癌都具有一定的療效[10-14]。有研究表明，將 CD40L 與腫瘤抗原融合表達，能夠通過 CD40L 的靶向作用將腫瘤抗原帶到 DC 表面，進而更加有效地將腫瘤抗原加工處理，并遞呈給 T 淋巴細胞[8]。在抗原加工處理和遞呈過程中，DC 的成熟是關鍵，而 GM-CSF 能夠促進 DC 的成熟和分化[9]。因此，CD40L 與腫瘤抗原融合表達結合 GM-CSF 能更加有效地激活機體的免疫反應。

本研究首先構建了含有 PSA 與 mCD40L 的融合蛋白基因，以及 GM-CSF 基因的質粒載體pUDK-PmL-IR-GM，并對其激活小鼠 T 淋巴細胞特異性免疫的作用進行了檢測。結果顯示，融合蛋白和 GM-CSF 的聯合應用，能夠從一定程度激活小鼠 T 淋巴細胞，包括 CD4+T 淋巴細胞與CD8+T 淋巴細胞比值升高；PSA 刺激可促進 T 淋巴細胞增殖；以及激活 T 淋巴細胞針對 PSA 抗原的特異性免疫反應等。結果表明，pUDK-PmL-IRGM 能在一定程度激活小鼠針對 PSA 的特異性免疫反應，從而為進一步應用于 PC 免疫基因治療提供實驗依據。

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