黃芩內(nèi)生細(xì)菌的分離及抑菌研究

郭 純，許召賢，呂晶森，周小江

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

內(nèi)生菌（Plant endophyte）是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于植物的各種組織和器官的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)的微生物，這些微生物有細(xì)菌、真菌、放線菌等[1-3]。植物內(nèi)生菌侵入寄主植物后，在特定的環(huán)境和生理?xiàng)l件下，不僅能脅迫促進(jìn)寄主體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的形成和累積，而且自身也可產(chǎn)生與宿主相同或不同的生理活性物質(zhì)。因此，從植物內(nèi)生菌入手來研究道地藥材的形成具有深遠(yuǎn)的意義[4-10]。

黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）為常用的著名的傳統(tǒng)中藥之一，是唇形科植物黃芩的干燥根，具有抗菌，消炎及抗病毒的功效[11]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于黃芩的研究主要集中在植物化學(xué)成分和栽培等方面，而內(nèi)生菌的研究較少且集中在內(nèi)生真菌，其內(nèi)生細(xì)菌研究尚未見報(bào)道[12]。為此，筆者對(duì)黃芩內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了分離，并研究了其發(fā)酵液抗菌的效果，旨在探索黃芩與其內(nèi)生細(xì)菌的關(guān)系以及進(jìn)一步尋找新的抗菌活性成分。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 子芩采自安徽亳州，經(jīng)鑒定為黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的根。

1.1.2 供試菌種 供試指示菌菌種為大腸桿菌（Escherichia coli），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），金黃色葡萄球菌（Staphylocccus aureus），均購(gòu)自廣東省微生物研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基 NA（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，pH值7.2。固體培養(yǎng)基另加2%的瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 黃芩內(nèi)生細(xì)菌的分離純化 （1）表面消毒：參考宋培勇等介紹的方法，稍做改進(jìn)。將黃芩根用蒸餾水沖洗，風(fēng)干表面水分，剪成小段，無菌水漂洗2次，75%酒精浸泡1min，再用0.1%氯化汞溶液浸泡10 min，轉(zhuǎn)入75%酒精中浸泡30 s，接著用無菌水漂洗3次，平放于 NA平板上，28℃培養(yǎng) 2～3 d。取最后一次漂洗液涂布NA平板作為對(duì)照。（2）內(nèi)生菌分離和純化：將NA平板上組織塊下或周緣長(zhǎng)出的菌落或菌苔劃線稀釋分離 1～2次直到獲得純培養(yǎng)。

1.2.2 黃芩內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鑒定 從菌落特征、革蘭氏染色特征、細(xì)胞形態(tài)特征等對(duì)分離菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.2.3 黃芩內(nèi)生細(xì)菌的發(fā)酵 將純化后的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接到裝有30mL NA液體培養(yǎng)基的100mL錐形瓶中，在30℃，160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，作為種子培養(yǎng)液。2 d后，移取1mL的種子培養(yǎng)液接種到裝有100mL PDA液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30℃，160 r/min條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)3 d。

1.2.4 發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定 將高溫滅菌后的濾紙片（R=8 mm）在離心得到的發(fā)酵液中浸泡，取出晾干，然后再浸泡1次，取出晾干，以加大濾紙片上有效物質(zhì)的濃度。將晾干的濾紙片放在涂有指示菌的培養(yǎng)基上，并且以無菌水和0.01 mg/mL的氨芐青霉素做對(duì)照。生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)2 d，觀察抑菌圈的有無以及測(cè)量抑菌圈的直徑（抑菌圈直徑=無菌圈直徑-濾紙片直徑）[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芩內(nèi)生細(xì)菌的分離

通過微生物學(xué)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和劃線稀釋分離方法從子芩中獲得內(nèi)生細(xì)菌8株。其中既有革蘭氏陰性菌株，又有革蘭氏陽(yáng)性；既有桿狀的，也有短桿狀或球狀的（表1）。

表1 黃芩8種內(nèi)生菌平板培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.2 黃芩內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液的抑菌性

8種黃芩內(nèi)生菌液體發(fā)酵后，對(duì)其進(jìn)行了抑菌活性測(cè)定。結(jié)果如表2所示，7種菌的發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)均有抑制作用，6種對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)有抑制作用，5株對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)有抑制作用。其中G8菌株發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌抑制作用效果最好，G6菌株發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌抑制作用效果最好。

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生菌還是一個(gè)未開發(fā)的新領(lǐng)域，它們所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)往往是新穎的，可能具有很好的應(yīng)用特性。研究表明，黃芩根中存在一定數(shù)量的內(nèi)生菌，其內(nèi)生菌對(duì)病原菌有抑菌活性。因此，利用黃芩內(nèi)生菌篩選高效、新穎、低毒的抗菌活性物質(zhì)存在很大的可能性。

表2 黃芩8種內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液抑菌效果

試驗(yàn)通過微生物學(xué)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和劃線稀釋分離方法從黃芩根中分離出內(nèi)生細(xì)菌8株。以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌為供試菌，對(duì)8種黃芩內(nèi)生菌液體發(fā)酵并進(jìn)行了抑菌活性測(cè)定，結(jié)果表明，黃芩內(nèi)生細(xì)菌對(duì)3種供試菌有一定的抑菌活性。

[1] Kloepper JW，Beauchamp C J.Issues related tomeasuring colonization of plant roots by bacteria[J].Can.J.Microbiol，1992，（38）：1219-1232.

[2] 張曉瑞.植物內(nèi)生菌及其開發(fā)應(yīng)用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，（11）：1747-1750.

[3] 劉云霞.植物內(nèi)生細(xì)菌的研究與應(yīng)用 [J].植物保護(hù)，1994，20（5）：30-32.

[4] 陳美蘭，歐陽(yáng)少華，林淑芬，等.植物內(nèi)生菌對(duì)地道藥材形成的影響[J].中藥研究與開發(fā)，2006，31（2）：9.

[5] 江愛兵，王開梅，張 鳳，等.植物內(nèi)生真菌及其次生代謝物的農(nóng)用研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（8）：7-10.

[6] 任愛梅，張麗珂，孟憲剛.植物內(nèi)生真菌研究進(jìn)展與存在問題[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（2）：103-106.

[7] 魏寶陽(yáng)，黃紅英，李順祥，等.黃花蒿內(nèi)生真菌的抑菌活性篩選[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，（4）：100-101

[8] 孫 奎，蘇印泉.無花果內(nèi)生真菌的抑菌活性篩選[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（23）：12455-12456，12459.

[9] 曹 鵬，朱永興，韋革宏.寧夏野生苦豆子中內(nèi)生菌的分離及拮抗細(xì)菌的篩選[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（24）：13098-13099.

[10] 顏 霞，何晶晶，趙 彬，等.假橐吾內(nèi)生菌分離及其拮抗菌的篩選與鑒定[J].西北植物學(xué)報(bào)，2010，30（5）：1029-103.

[11] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中國(guó)藥典一部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[12] 陳秀清，齊香君，何恩銘.中藥黃芩研究新進(jìn)展[J].食品與藥品，2006，89（5）：23-26.