乙型肝炎病毒rtN238H變異與阿德福韋酯耐藥的相關性研究*

朱華 鐘彥偉 許智慧 劉佳慧 劉妍 蘇何玲 徐東平

研究表明，應用阿德福韋酯（ADV）1年、2年、3年、4年和5年的相關耐藥突變累積發生率分別為0%、3%、11%、18%和 29%[1]。目前，明確的 ADV經典耐藥變異有rtN236T和 rtA181V，這兩種變異單獨或聯合出現后可引起HBV對ADV的敏感性下降2～20倍，引起病毒學和生化學反跳[2～4]。還有一些與ADV耐藥相關變異的報道，但未被公認，被稱為提議（proposed）、次要（minor）或爭議（debating）變異，包括rtV84M、rt181T、rtV214A、rtQ215S、rtL217R、rtI233V 和rtN238D/T等[5，7]。如果對ADV的敏感性下降僅3倍（其他3種藥物均在50倍以上）即可引起臨床耐藥，使表型耐藥分析結果不易判斷[8]。我們在對HBV感染患者的檢測中發現，在rtN238位點上rtN238H變異較rtN238D/T更為常見，且在ADV經治患者中的檢出率高于ADV未治患者。本文對HBV rtN238H進行了進一步分析研究，以明確該變異是否與ADV耐藥有關。

對象與方法

一、研究對象 2005年～2010年期間解放軍第302醫院收住的慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者1789例，均接受了HBV DNA序列測定。另于2005年12月收住慢性乙型肝炎患者（男，33歲）1例，取血進行HBV表型耐藥分析，患者HBsAg、HBeAg和抗-HBc陽性，HBV DNA陽性，給予ADV（美國葛蘭素公司）治療，病情逐漸好轉，納差癥狀消失，谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）恢復正常，HBV DNA轉為陰性。2007年8月患者自行停用ADV，20天后再次出現乏力納差表現，血清HBsAg、HBeAg、抗-HBe和抗 -HBc陽性，總膽紅素 /直接膽紅素（T/DBIL）21.3/7.2μmol/L，ALT 557U/L、AST 188U/L，HBV DNA 7.295×105copies/mL。于2007年10月再次入院，給予ADV治療，病情未見好轉，HBV DNA仍為4.40×103copies/ml，HBV DNA序列測定檢出rtN238H變異，未檢出rtA181V、rtN236T或其它經典耐藥變異，前C/BCP區有A1762T+G1764A雙聯變異，無G1896A變異；其HBV基因型分型為C型。

二、HBV DNA序列測定 HBV基因擴增的單管巢式PCR方法為我室建立，擴增測序的兩個基因片段（nt 541378、nt 15832227）分別包括了HBV逆轉錄酶區和前C/基本核心啟動子區。根據測序結果進行HBV基因變異分析和基因分型[9，10]。

三、HBV基因定點突變 提取血清HBV DNA，經巢式PCR擴增后克隆到pGEM-Teasy載體中（美國Promega公司），根據需要合成定點變異引物，將rtN238H回復突變為野生序列。采用的定點試劑為美國Applied Biosystems公司產品，引物序列和定點突變操作按照我室以前發表的文獻方法進行[11]。隨機挑選3～5個克隆測序，獲得該患者HBV野生株（wt）。

四、病毒表型耐藥與體外復制力檢測 取HepG2細胞購于美國模式培養物集存庫（ATCC），經DMEM（含 10%FBS，青霉素 100U/ml，鏈霉素 10μg/ml）培養；轉染試劑 FuGENE HD Transfection Reagent購于Roche公司，pTriEx-HBV1.1表達載體由法國里昂大學Zoulim教授惠贈，HBV載量熒光定量試劑盒為上海復興醫學科技發展有限公司產品。提取含有HBVT基因的質粒，用Xho I和Nco I雙酶切目的基因片段及pTriEx-HBV1.1表達載體，電泳后回收目的基因片段（1250bp）及pTriEx-HBV1.1表達載體片段，連接后轉化大腸桿菌，隨機挑取克隆進行測序，確定HBV表達載體構建成功。將ADV溶于DMSO，配制成濃縮液（10mmol/L），臨用前稀釋成所需濃度。將HepG2細胞接種于24孔板（10萬/孔），18小時后每孔轉染0.25μg質粒，5小時后，細胞用1×PBS洗3遍，加入含不同濃度的培養液培養（ADV的濃度為 0、0.033、0.1、0.33、1.00和3.33μmol/L），隔天換液一次。換液后2天，收集細胞培養上清，用DNase消化游離DNA后，加入終濃度為5mmol/LEDTA 75℃15min滅活DNase，裂解釋放Dane顆粒中的DNA，進行定量檢測，計算藥物的半數有效濃度（EC50）值，變異與野生株的EC50比值代表對藥物敏感性的改變程度，未加藥孔細胞上清HBV DNA水平代表病毒的復制力水平。

結果

一、rtN238H變異發生率情況 在1789例慢性乙型肝炎患者中，共在rt238位點上檢出各類變異231例（12.9%），其中 rtN238H變異 181例（10.1%），后者16例（0.89%）與經典ADV耐藥變異（rtN236V/rtA181V）共存；另檢出 rtN238T 10例（0.56%），rtN238D 3例（0.17%），rtN236S 19例（1.06%），rtN236X 8例（0.45%），rtN236K 5例（0.28%），rtN236Q 2例（0.11%），rtN236Y、rtN236L和rtN236A各1例（0.06%）。

在181例rtN238H變異患者中，男153例，女28例，年齡 36.7±12.9 歲，ALT 118.0±202.7U/L，TBIL 23.4±41.3μmol/L，HBV DNA載量為lg7.78±3.34copies/ml。ADV經治和未治患者分別為130例（71.8.%）和51例（28.2%），其中對ADV治療產生臨床應答（含部分應答）的占82.3%（107/130），無應答或出現病毒學反跳的占17.7%（23/130）。181例中HBV B基因型感染為151例（83.4%），C基因型感染為30例（16.6%）。

二、病毒復制力與表型耐藥情況 將含有rtN238H變異和對應的野生型序列的HBV表達載體瞬時轉染HepG2細胞，并經ADV處理，取轉染細胞分泌培養上清進行定量，取3次獨立實驗的平均值（表1）。按照不同ADV藥物濃度計算N238H變異株EC50=0.10±0.07μmol/L，回復突變野生株 EC50=0.08±0.04μmol/L，變異株是野生株的1.25倍（圖 1）。

表1 rtN238H變異株和野生株在不同藥物濃度下的復制水平

圖1 阿德福韋對HBV rtN238H變異株和野生株抑制率的比較

討論

由于在HBV復制過程中存在逆轉錄過程，其多聚酶/逆轉錄酶缺乏糾錯能力，容易產生變異（大約為10-7/核苷酸/天），但由于HBV基因組各讀碼框架間存在編碼基因共用，使變異對病毒產生損害的機率增加；變異病毒需要進入其生命周期中獨特的cccDNA池才能相對穩定，因而HBV變異株的產生機率又低于HCV、HIV等RNA病毒[12]。核苷（酸）類藥物長期應用，可以使對環境壓力適應力強的變異病毒獲得適應性突變和選擇性擴增，或使已存在于準種群中的極少量變異株獲得選擇性擴增，產生的變異如果引起病毒對藥物敏感性的顯著下降，被稱為原發耐藥變異；如變異雖不影響藥物敏感性，但可顯著增強耐藥變異株的復制力，被稱為復制力補償變異。這兩種類型的變異均對臨床耐藥具有意義。耐藥相關病毒變異具有以下幾個特征：①與應用治療藥物相關；②臨床上出現病毒學反彈和（或）病情反復；③表型耐藥分析能證明變異病毒對治療藥物的敏感性降低或引起病毒復制力增強；④可能出現在多個病例；⑤停藥后病毒有可能恢復為野生型[13]。

我們在對臨床大樣本的HBV進行變異檢測中發現rtN238H有較高的發生率，同時注意到有文獻報道該位點發生的rtN238D和rtN238T變異與ADV耐藥相關。為此，我們對rtN238H與ADV耐藥相關性進行了分析。結果表明，HBV rtN238H變異的檢出率為10.1%，明顯高于 rtN238T（0.56%）和 rtN238D（0.17%），且ADV經治患者中rtN238H變異的檢出率明顯高于ADV未治患者。為此，我們通過表型耐藥和體外復制力分析實驗進一步明確該變異是否與阿德福韋耐藥相關，但結果表明，rtN238H變異株的體外復制力與野生株接近，對ADV的EC50值為野生株的1.25倍，而文獻報道引起ADV耐藥變異EC50值至少升高2倍，我們對經典的rtN236T變異株和A181V變異株的表型耐藥分析結果也顯示它們的ADV EC50較野生株上升了3～18倍，說明rtN238H變異對ADV耐藥無直接聯系。從臨床應答分析，該患者雖然產生了rtN238H變異，但ADV治療期間患者血清HBV病毒載量從7.295×105copies/ml下降至 4.4×103copies/ml，病毒未能轉陰的原因可能與ADV抑制病毒效果相對較弱有關。在所有檢出rtN238H變異的ADV經治患者（181例）中，臨床取得完全或部分應答的占82.3%，也提示rtN238H與ADV耐藥可能沒有直接的關系。

本研究選擇克隆了一個代表病例HBV rtN238H變異株，同時通過回復點突變獲得了與變異株背景序列完全相同的野生株。本文采用pTriEx-HBV1.1和HepG2細胞系統用于瞬時表達HBV進行病毒復制力和表型耐藥測定，該系統可以獲得較高的病毒復制表達水平，便于進行表型耐藥分析[14]。我們建立了時實熒光定量PCR方法進行表型耐藥分析，對拉米夫定等經典耐藥變異的表型耐藥分析取得了良好的效果[15]。用細胞培養上清HBV DNA定量進行表型耐藥分析已在一些研究中應用[3，16，17]。我們通過對多種典型耐藥變異HBV的表型耐藥分析，表明定量檢測上清病毒與定量檢測核心顆粒來評估病毒水平的結果一致性良好（結果未列出）。

在研究中我們發現在rtN238H變異，B基因型感染的比例為83.4%，而C基因型為16.6%，而總樣本中C基因型感染患者占到80%，遠遠高于B基因型感染患者。國內外不少研究表明C基因型感染較B基因型感染更易發生慢性化和肝癌。我們的研究表明在我國北方地區，HBV C2基因型/B2基因型感染在急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、慢加急性肝衰竭和肝癌患者中的比值分別為 1.7、5.7、7.5、8.0 和 15.3[18]。但 rtN238H 變異是否對不同基因型感染的臨床意義產生影響尚待進一步研究?？傊?，本研究也為分析臨床檢出的HBV特殊變異形式與耐藥的相關性建立了方法學基礎，通過對大樣本變異的臨床資料和體外表型耐藥分析證實rtN238H對ADV敏感性和復制力無直接的影響。

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