丁苯酞對AD大鼠模型海馬BACE及NEP活性含量的影響

陳 蕓,李海洋

阿爾茨海默病為神經系統退行性疾病,是老年性癡呆的主要類型之一,其發病機制尚未闡明,但較為公認的是Aβ級聯假說[1]。Aβ在顳葉、海馬的沉積可引起細胞內鈣穩態失衡、氧化應激、炎癥免疫、細胞凋亡、線粒體損傷、膽堿能系統的損傷等,最終引起神經元的喪失,產生記憶力及認知的下降。因此,Aβ在AD的發病中起著關鍵性作用,而減少Aβ沉積成為治療AD的一條重要途徑。丁苯酞可以減少AD模型大鼠海馬Aβ的沉積[2],其可能機制之一是促進α分泌酶的表達[3],但丁苯酞是否會影響Aβ代謝其他重要途徑尚不清楚。β分泌酶(BACE)是Aβ產生過程中第一個限速酶,而中性內肽酶(NEP)是腦內重要的Aβ降解酶。本實驗通過檢測影響Aβ代謝BACE和NEP,探討丁苯酞減少AD大鼠模型腦內Aβ沉積的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康雄性Wistar大鼠40只(山西醫科大學實驗動物中心提供),體重280 g～320 g。隨機分為4組:假手術組、模型組、丁苯酞低劑量組、丁苯酞高劑量組,每組各10只,自由進食、飲水,自然晝夜節律光照。

1.2 藥品、試劑與儀器 丁苯酞(恩必普,NBP)由石藥集團恩必普藥業有限公司提供;Aβ1-40蛋白片段(北京博奧森);大鼠腦內β-分泌酶、中性內肽酶活性 ELISA 試劑盒(美國 R&D);江灣1C型腦立體定位儀;FA 2004/1104型電子天平(上海天平儀器廠);玻璃勻漿器(天津科器集團公司);離心機(LD5-2A,北京醫用離心機廠);電熱恒溫培養箱Jc303型(上海成順儀器儀表有限公司);Wellscan MK-3全自動多功能酶標儀(芬蘭 Labsystems Dragon公司)。

1.3 模型建立及給藥 采用大鼠海馬立體定向注射凝聚態Aβ1-40誘導AD模型[3]。將丁苯酞溶于植物油中,制成濃度為10 mg/mL植物油與藥物混合物進行灌胃;根據人和動物按體表面積折算的等效劑量,丁苯酞高劑量組按60 mg/kg給藥,丁苯酞低劑量組按30 mg/kg給藥,假手術組和模型組大鼠給予等體積植物油,造模手術后第一天即給藥,灌胃共4周,均每日1次灌胃。

1.4 海馬組織勻漿β分泌酶及中性內肽酶的活性含量測定灌胃滿4周后處死大鼠,進行麻醉,快速斷頭,在冰盤上迅速將兩側海馬剝離(右側海馬用以β分泌酶的檢測,左側海馬用以中性內肽酶的檢測),用冰冷的生理鹽水沖凈海馬表面血跡,濾紙拭干,后以電子天平稱重;按1 g∶10 mL冰水溶液中用玻璃勻漿器研磨制成勻漿,4℃3 500 r/min離心10 min,取上清液,制成10%海馬腦組織勻漿。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中大鼠海馬組織勻漿中β分泌酶及中性內肽酶的活性含量。

2 結 果

2.1 β分泌酶的活性含量(見表1)與假手術組相比,模型組大鼠海馬組織勻漿中β分泌酶的活性含量明顯增加(P＜0.01);但與模型組比較,丁苯酞低劑量組、高劑量組β分泌酶的活性含量沒有明顯降低;低、高劑量丁苯酞組β分泌酶的活性含量差異也無統計學意義。

表1 丁苯酞對AD大鼠海馬BACE活性含量的影響(±s)

表1 丁苯酞對AD大鼠海馬BACE活性含量的影響(±s)

組別 動物數(只)BACE(pg/mL)假手術組 10 23.08±2.70模型組 10 35.41±3.091)丁苯酞低劑量組 10 33.23±3.271)丁苯酞高劑量組 10 33.84±3.611)與假手術組比較,1)P＜0.01

2.2 中性內肽酶活性 與假手術組大鼠相比,模型組大鼠海馬組織勻漿的中性內肽酶活性明顯增加(P＜0.01);與模型組比較,丁苯酞低劑量組、高劑量組大鼠海馬組織勻漿的中性內肽酶的活性含量明顯降低;低、高劑量丁苯酞組大鼠海馬組織勻漿的中性內肽酶的活性,差異無統計學意義。詳見表2。

表2 丁苯酞對AD大鼠中性內酶活性含量的影響(±s)

表2 丁苯酞對AD大鼠中性內酶活性含量的影響(±s)

組別 動物數(只)NEP(pg/mL)假手術組 10 65.17±2.33模型組 10 43.72±3.261)丁苯酞低劑量組 10 62.06±2.452)丁苯酞高劑量組 10 63.23±2.832)與假手術組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.01

3 討 論

阿爾茨海默病的發病機制雖然尚未闡明,但Aβ在AD發病過程中的重要地位已有廣泛共識。Aβ由APP水解產生,它水解途徑有兩條:第一條以α分泌酶、γ分泌酶水解[4],該途徑不產生β淀粉樣蛋白,而產生可溶性蛋白 sAPPα[5],這也是APP加工的主要途徑。第二條是APP分別由β分泌酶、γ分泌酶水解,該途徑產生完整的 Aβ[4,6]。β分泌酶作為 Aβ生成的限速酶,近年來已成為研究癡呆藥物的重要靶標[7]。在臨床研究中,Holsinger等[8]分析了21例AD患者腦脊液(CSF)中BACE的活性后,發現CSF中BACE活性增強。Zhong等[9]研究了80例癡呆患者,磁共振、免疫組化結果顯示,癡呆組BACE濃度比對照組正常人群明顯增高。β分泌酶升高在Aβ生成中起著重要作用。抑制β分泌酶將會減少Aβ生成。本實驗結果顯示,AD模型大鼠海馬組織中β分泌酶活性含量明顯升高,但卻未發現丁苯酞能夠減少其β分泌酶的活性含量,丁苯酞抑制Aβ沉積可能不通過減少β分泌酶的活性含量這條途徑。

AD的主要發病原因是Aβ的不完全清除(大于98%的AD病例)[10]。NEP是腦內主要的Aβ降解酶,位于細胞軸突和突觸膜上,屬Zn金屬蛋白酶家族,是分子量約為 186KDa的Ⅱ型跨膜糖蛋白,可降解Aβ單體和寡聚體。其表達下調加劇Aβ聚集,表達上調降低腦內Aβ水平;NEP在AD患者腦內老年斑塊區域含量最少,而腦周圍的功能區域NEP表達基本正常。因此,NEP的降低可以作為AD早期發病的危險因素之一[11],其升高則有利于Aβ降解。本實驗研究顯示,模型組大鼠海馬組織NEP含量明顯降低,而用藥組大鼠海馬組織的中性內肽酶活性含量明顯增高,但尚未超過正常組,說明丁苯酞可能通過促進中性內肽酶的活性含量從而加速Aβ的降解,減少Aβ的沉積。

丁苯酞提取于芹菜籽,可能通過保護線粒體的機制改善AD患者的認知。有研究者間斷向大鼠腦內注射Aβ,制成AD模型大鼠并給予丁苯酞治療,結果顯示丁苯酞可以通過抑制細胞凋亡、過抗氧化、降低tau蛋白磷酸化等途徑改善AD大鼠的認知能力[12]。丁苯酞可以成為治療阿爾茨海默病潛在的治療藥物,并可能通過多機制、多靶點改善阿爾茨海默病記憶及認知功能。而減少Aβ的沉積能從根本上抑制Aβ的神經毒性。Aβ有一個生成和降解的平衡過程,正是由于這個生成與降解的過程發生異常使Aβ在腦部增多、沉積。丁苯酞可以減少Aβ的沉積,改善AD模型大鼠的認知。其可能的機制之一是通過促進α分泌酶的表達,將 APP裂解為可溶性的APP片段sAPPα,減少APP分解為Aβ[3]。結合本實驗,丁苯酞也可能通過促進中性內肽酶的活性含量,加速Aβ的降解,從而恢復Aβ生成和降解的平衡,即抑制Aβ的生成,促進 Aβ的降解,最終減少 Aβ的沉積。但是否還有其他機制的參與有待更進一步的研究。

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