清開(kāi)靈對(duì)缺氧體外血腦屏障緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)的影響1)

朱海燕,馬 濤,婁利霞,婁晉寧,劉明嶺,徐 冰,高永紅

缺血性中風(fēng)一直是臨床上的治療難題,血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的破壞既是腦缺血損傷的結(jié)果,又是進(jìn)一步導(dǎo)致腦損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1],而B(niǎo)BB通透性的改變與緊密連接(tight junction,TJ)的主要成分ZO-1分布及缺失密切相關(guān)[2]。清開(kāi)靈對(duì)缺血性中風(fēng)急性期患者有良好的治療作用[3,4]。探討腦缺血后BBB上主要功能蛋白ZO-1的改變及清開(kāi)靈對(duì)其表達(dá)的影響,對(duì)腦中風(fēng)初期的治療及預(yù)后具有重要意義,同時(shí)還有助于揭示清開(kāi)靈抗腦缺血性損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 Balb/c小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系細(xì)胞(中日友好醫(yī)院婁晉寧教授惠贈(zèng)),經(jīng)抗Ⅷ因子抗體、抗CD31抗體及DiI-乙酰化低密度脂蛋白標(biāo)記攝取檢測(cè),符合內(nèi)皮細(xì)胞特性[5]。

1.2 主要藥品及試劑 清開(kāi)靈注射液(每支 10 mL,批號(hào):810906A,北京中醫(yī)藥大學(xué));內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(由中日友好醫(yī)院臨床研究所病理生理室提取);SV總RNA純化系統(tǒng)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒(promega公司);Power Sybr Green PCR Master Mix(ABI公司);PVDF膜(millipore公司);RIPA裂解液(普利萊基因公司);ECL發(fā)光液(碧云天公司);蛋白質(zhì)Marker(Fermentas公司);Cocktail蛋白酶抑制劑、PhosSTOP磷酸酶抑制劑(Roche公司);BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒(塞馳公司)。

1.3 主要儀器 M x3000p定量PCR儀(ZA29-M x3000P,Stratagene公司);倒置相差顯微鏡(Olympus IM T-2);高速冷凍離心機(jī)(HC-3018R,科大創(chuàng)新)。低氧 CO2培養(yǎng)箱(MiniGalaxy A,RS biotech公司);CO2培養(yǎng)箱(MCO-20AIC,SANYO公司),可見(jiàn)光紫外分光光度計(jì)(Multispec1501,島津公司);Genegenome凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司);BioRad Mini-4垂直電泳槽和轉(zhuǎn)膜儀(Biorad公司);Genegenome凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司)。

1.4 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 液氮中取出細(xì)胞凍存管,37℃水浴箱迅速融化,傳至已用明膠包被的培養(yǎng)瓶中,放入適量?jī)?nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),1 d～2 d換液,3 d～4 d傳代一次,用胰酶消化細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)采用第24代細(xì)胞。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 將單細(xì)胞懸液接種于60mm培養(yǎng)皿中,每皿5×105mL個(gè)細(xì)胞,加培養(yǎng)基 4 mL,置CO2培養(yǎng)箱中孵育,待細(xì)胞90%以上融合時(shí)隨機(jī)分為5組。正常對(duì)照組,細(xì)胞培養(yǎng)液換成有糖Earle液,在CO2培養(yǎng)箱中正常24 h培養(yǎng)。模型組,采用缺氧缺糖模擬缺血。細(xì)胞培養(yǎng)液換成無(wú)糖 Earle液,在培養(yǎng)條件為37℃,5%CO2,1%O2的低氧CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。清開(kāi)靈低、中、高劑量組,缺氧缺糖同時(shí)分別加入0.25%、0.50%、1.00%清開(kāi)靈培養(yǎng)24 h。尼莫地平組,缺氧缺糖同時(shí)加入100 μ g/mL尼莫地平培養(yǎng)24 h。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)

1.6.1 總RNA提取 采用SV總RNA純化系統(tǒng)試劑盒提取總RNA,在紫外分光光度計(jì)中測(cè)OD260、OD280值,計(jì)算 RNA濃度和含量。采用反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。1.6.2 引物合成 通過(guò)檢索NCBI獲得小鼠ZO-1 mRNA基因序列,引物交由北京奧科鼎盛生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。ZO-1:Forward5'-AGGACACCAAAGCATGTGAG-3',Reverse 5'-GGCATTCCTGCTGGTTACA-3',擴(kuò)增片段長(zhǎng)度86 bp;內(nèi)參 β-actin:5'-AGG CCA ACC GTG AAA AGA TG-3',Reverse 5'-TGG CGT GAG GGA GAG CAT AG-3',擴(kuò)增片段長(zhǎng)度185bp。

1.6.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件:總反應(yīng)體系25 μ L,2 mix 12.5 UL,無(wú) RNA 酶水 5.5 U L,cDNA 5 UL,上游引物 1 UL(10 μ mol/L),下游引物 1 UL(10 μ mol/L),反應(yīng)條件:95℃10 min預(yù)變性;然后95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,40次循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算CT值。擴(kuò)增效率標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、熔解曲線(xiàn)和擴(kuò)增曲線(xiàn):每個(gè)引物均把CDNA按倍比稀釋5次。觀(guān)察熔解曲線(xiàn)和擴(kuò)增曲線(xiàn)。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、熔解曲線(xiàn)和擴(kuò)增曲線(xiàn) 求得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),基因擴(kuò)增效率(Eff)=95.2%,相關(guān)系數(shù)(Rsq)=0.999,可見(jiàn)引物的Eff在(100±10)%,Rsq＞0.98,呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。各組目的基因PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線(xiàn)平滑,有明顯的指數(shù)擴(kuò)增期;熔解曲線(xiàn)為單特異峰,Tm值均＞80℃,說(shuō)明沒(méi)有引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 熒光實(shí)時(shí)定量ZO-1基因轉(zhuǎn)錄量 CT值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),根據(jù)2-△△CT法求出初始cDNA的相對(duì)量。模型組ZO-1基因轉(zhuǎn)錄量顯著低于正常對(duì)照組(P＜0.01);清開(kāi)靈中、高劑量組和尼莫地平組能明顯升高缺氧復(fù)氧后微血管內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1的基因轉(zhuǎn)錄,(較模型組)(P＜0.01)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組ZO-1基因轉(zhuǎn)錄量(±s)

組別 n ZO-1正常組 6 1.017±0.11991)模型組 6 0.313±0.0542)清開(kāi)靈低劑量組 6 0.433±0.1382)清開(kāi)靈中劑量組 6 0.702±0.1271)清開(kāi)靈高劑量組 6 0.983±0.3601)尼莫地平組 6 0.834±0.1331)與模型組比較,1)P＜0.01;與正常組比較,2)P＜0.01

2.3 ZO-1蛋白表達(dá)量 與正常對(duì)照相比,模型組ZO-1表達(dá)量降低78.90%,表明缺氧損傷能顯著抑制細(xì)胞ZO-1蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。與模型組相比,低、中、高劑量清開(kāi)靈分別使ZO-1的表達(dá)量提高3.635倍(或 363.51%)、5.554倍(或 555.40%)和7.919倍(或791.89%),清開(kāi)靈可顯著提高缺氧損傷后細(xì)胞ZO-1蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。清開(kāi)靈高劑量組增加ZO-1蛋白的表達(dá)非常顯著,甚至超過(guò)正常組該蛋白的表達(dá)水平(P＜0.01)。詳見(jiàn)表2。

表2 ZO-1蛋白表達(dá)量(±s)

表2 ZO-1蛋白表達(dá)量(±s)

組別 n ZO-1正常組 6 0.35±0.1311)模型組 6 0.074±0.0133)清開(kāi)靈低劑量組 6 0.343±0.0981)清開(kāi)靈中劑量組 6 0.485±0.1482)清開(kāi)靈高劑量組 6 0.660±0.1392)尼莫地平組 6 0.582±0.1322)與模型組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與正常組比較,3)P＜0.05

3 討 論

缺血性腦中風(fēng)會(huì)首先損傷大腦的BBB,使其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,造成BBB的屏障功能下降,通透性增加[6]。Preston[7]等通過(guò)計(jì)算BBB對(duì)大分子示蹤劑和水分子示蹤劑通透性的轉(zhuǎn)運(yùn)常數(shù)發(fā)現(xiàn),大鼠短暫性腦缺血再灌注后BBB通透性的增加主要是由TJ開(kāi)放導(dǎo)致,而并非是胞飲轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng),腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的TJ閉鎖小帶長(zhǎng)度隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少。

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的TJ是BBB最主要的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),它能夠封閉內(nèi)皮細(xì)胞頂部的細(xì)胞間隙,阻止細(xì)胞外的大分子物質(zhì)經(jīng)細(xì)胞間隙進(jìn)入組織內(nèi),是BBB發(fā)揮屏障功能的主要結(jié)構(gòu)[8]。在TJ的構(gòu)成及功能等方面發(fā)揮重要作用的胞質(zhì)附著蛋白家族,尤其是ZO-1的缺失、分裂,與屏障滲透性的增加有著密切的關(guān)系[9]。ZO-1是第一個(gè)被證實(shí)的TJ胞質(zhì)蛋白,是膜結(jié)合鳥(niǎo)苷酸激酶同系物家族中唯一可形成高度穩(wěn)定二聚體的蛋白[10]。正常情況下,ZO-1在細(xì)胞膜表面表達(dá),并且在胞質(zhì)內(nèi)有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn),能與跨膜蛋白和TJ蛋白的C端相互作用,將跨膜蛋白和細(xì)胞骨架連接在一起。同時(shí),ZO-1還與另一個(gè)胞質(zhì)附著蛋白2扣帶蛋白的尾端相連,為附著蛋白和跨膜蛋白的連接提供支架。因此,ZO-1對(duì)維持TJ的連續(xù)性和完整性發(fā)揮重要作用。

BBB的破壞既是腦缺血損傷的結(jié)果,又是進(jìn)一步導(dǎo)致腦損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在缺血早期,微血管內(nèi)皮細(xì)胞上炎癥因子的表達(dá)使缺血性損傷向炎性損傷轉(zhuǎn)變,白細(xì)胞與微血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附后從血管內(nèi)向腦實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移,改變TJ的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致ZO-1的崩解,進(jìn)而誘發(fā)血管源性水腫和出血[11,12]。

清開(kāi)靈可以抑制缺血損傷的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥調(diào)節(jié)因子NF-κ B的表達(dá),下調(diào)黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)水平,減少白細(xì)胞的黏附[13,14]。本研究發(fā)現(xiàn),缺血24 h后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)均明顯減少,而清開(kāi)靈可明顯增加ZO-1的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),并表現(xiàn)出劑量依賴(lài)的趨勢(shì)。但是清開(kāi)靈對(duì)ZO-1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的影響并不平行,對(duì)ZO-1轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)表現(xiàn)出更強(qiáng)的干預(yù)作用,使蛋白表達(dá)顯著升高,清開(kāi)靈高劑量組ZO-1的表達(dá)量甚至超過(guò)了正常狀態(tài)下BBB的表達(dá),這說(shuō)明損傷狀態(tài)下的BBB對(duì)清開(kāi)靈的反應(yīng)非常敏感。清開(kāi)靈能通過(guò)其他途徑放大其對(duì)ZO-1蛋白表達(dá)的影響。

“毒損腦絡(luò)”是清開(kāi)靈治療缺血性腦中風(fēng)的理論基礎(chǔ)。該理論認(rèn)為中風(fēng)發(fā)病是由于毒邪損傷腦絡(luò),絡(luò)脈破損或絡(luò)脈拘攣瘀閉,氣血滲灌失常所致[15]。腦微血管在分布和功能等方面與中醫(yī)絡(luò)脈相似[16],清開(kāi)靈不但能夠抑制缺血后白細(xì)胞活化對(duì)微血管內(nèi)皮的毒性損傷,還能恢復(fù)腦微血管BBB的分子結(jié)構(gòu)和功能,進(jìn)而保證氣血的正常運(yùn)行。有關(guān)清開(kāi)靈對(duì)TJ的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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