安定在保存血液中的分解動(dòng)力學(xué)研究1)

溫昕娟,曹 潔,朱培培,張大明,贠克明

安定是臨床上常用的鎮(zhèn)靜催眠藥,但長(zhǎng)期服用或大量服用均可引起中毒,安定中毒的案例時(shí)有報(bào)道[1-3]。本研究建立安定灌胃中毒致死犬的動(dòng)物模型,研究安定在保存犬血液中的分解動(dòng)力學(xué)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和試劑 T race DSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國(guó)Finnigan公司;島津2010GC氣相色譜儀,日本島津公司;安定標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)于公安部二所);內(nèi)標(biāo):SKF525(中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)開(kāi)發(fā)公司);其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本地雜種犬6只,15 kg～20 kg,雄性,山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制 安定、內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液的配制:分別精密稱(chēng)取安定、丙基解痙素(SKF525A,內(nèi)標(biāo)物)標(biāo)準(zhǔn)品適量,用無(wú)水乙醇溶解并定量稀釋制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.2 色譜分析條件 氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析條件:DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 mm)毛細(xì)管柱;載氣為高純氦氣,恒流模式,流速1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度 250℃;柱溫為程序升溫:200℃(1 min)→20℃/min→280℃(6 min);傳輸線溫度 250℃;電子轟擊電離源(EI),電子能量70 eV,離子源溫度250℃;自動(dòng)調(diào)諧方式,發(fā)射電流強(qiáng)度 100 μ A;掃描起始時(shí)間4 min,掃描范圍50 amu～650 amu;分流進(jìn)樣,分流比為10∶1。氣相色譜分析條件:DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 mm)毛細(xì)管柱;載氣為高純氮?dú)?恒壓模式,壓力150 kPa;進(jìn)樣口溫度:250℃;柱溫:200℃(1 min)→20℃/min→280℃(6 min);NPD檢測(cè)器,溫度 300℃;不分流進(jìn)樣。

1.2.3 提取分離與檢測(cè) 血液 1 mL,加水3 mL,加入內(nèi)標(biāo)物SKF52510 μ g,硼酸緩沖溶液調(diào)pH 為10,5 mL乙醚萃取,振蕩10 min,離心,取上清液4 mL置于干燥離心管中。乙醚重新萃取一次,合并有機(jī)相,40℃恒溫水浴中揮干。殘?jiān)?0 μ L乙醇定容,取1 μ L進(jìn)樣。保留時(shí)間結(jié)合特征離子峰定性,內(nèi)標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法(氣相色譜)定量。

1.2.4 保存犬血中的分解動(dòng)力學(xué) 雄性犬6只,插胃管,2 min內(nèi)注入2 LD50劑量安定[4],每只犬血分4等份置于20℃、4℃、-20℃、20℃(加氟化鈉至濃度為1%)中,于0、7d、14d、28d,60 d、90 d、150 d、210 d檢測(cè)血液中安定含量。采用 WinNorLin藥代動(dòng)力學(xué)軟件處理平均藥物濃度,擬合分解動(dòng)力學(xué)方程,計(jì)算分解半衰期。

2 結(jié) 果

2.1 GC和GC/MS檢測(cè) 安定與內(nèi)標(biāo)物及內(nèi)源性雜質(zhì)分離良好。詳見(jiàn)圖1～2。

2.2 工作曲線 取空白血分別添加安定0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0、32.0、48.0 μ g 按前述 2.1方法提取測(cè)定。所建立的血中安定檢測(cè)工作曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、最低檢出限分別為Y=3.0519X-2.8942(X為安定和內(nèi)標(biāo)物峰面積比值 ;Y為安定含量 ,μ g/mL或μ g/g)、0.1～ 32μ g/mL、0.998 8μ g/mL 、0.05μ g/mL 。

2.3 回收率及精密度 精密吸取15份空白全血1 mL,分為3組,分別加水3 mL,混勻。每組分別加入安定0.5、1.0、4.0 μ g,按2.1全血樣品處理項(xiàng)方法處理測(cè)定。同時(shí)取1 d內(nèi)5次測(cè)定結(jié)果計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差,以3 d內(nèi)5次測(cè)定結(jié)果計(jì)算日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差。詳見(jiàn)表1。

表1 安定提取回收率及精密度(n=5)

2.4 分解動(dòng)力學(xué)研究

2.4.1 溫度對(duì)保存血液中安定濃度的影響(見(jiàn)表 2、表3)

表2 溫度對(duì)保存血液中安定濃度的影響(±s)μ g/mL 或μ g/g

表2 溫度對(duì)保存血液中安定濃度的影響(±s)μ g/mL 或μ g/g

時(shí)間(d)20℃ 4℃ -20℃ 20℃(1%NaF)0 102.376±8.560 102.376±8.560 102.376±8.560 102.376±8.560 102.205±6.078 78.724±7.870 87.258±6.620 113.112±4.382 28 90.128±5.637 67.507±5.3921) 64.951±3.0581) 95.906±1.466 56 56.874±2.1351) 31.511±4.4521) 18.520±1.0851) 41.235±6.3711)90 28.560±1.6331) 27.156±3.6401) 15.593±4.1091) 29.748±4.2381)150 26.357±4.4291) 19.632±1.5471) 12.155±3.4241) 19.839±2.0251)210 19.121±4.7991) 26.077±7.9191) 15.529±8.8161) 21.056±8.2331)方差分析,bonferroni法與0時(shí)相比,1)P＜0.05 7

表3 溫度對(duì)保存血液中安定下降百分比的影響(±s)%

表3 溫度對(duì)保存血液中安定下降百分比的影響(±s)%

時(shí)間(d)20℃ 4℃ -20℃ 20℃(1%NaF)0 100.0±8.3 100.0±8.3 100.0±8.3 100.0±8.3 99.8±6.1 76.8±7.6 85.2±6.4 110.4±4.2 28 88.0±5.5 65.9±5.21) 63.4±2.91) 93.6±1.4 56 55.5±2.11) 30.7±4.31) 18.0±1.01) 40.2±6.21)90 28.5±1.61) 26.5±3.51) 15.2±4.11) 29.2±4.11)150 27.8±1.51) 19.1±1.51) 11.8±3.31) 19.3±1.91)210 18.6±4.61) 25.4±7.71) 15.1±7.51) 20.5±8.01)方差分析,bonferroni法與0時(shí)相比,1)P＜0.05 7

2.4.2 分解動(dòng)力學(xué)參數(shù)和方程 采用WinNorLin藥代動(dòng)力學(xué)軟件處理平均藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)。其分解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程,可用 Ct=C1e-αt+C2e-βt(Ct 為時(shí)間 t測(cè)得的含量;C1、C2表示初始含量;t表示時(shí)間,單位:天;α、β為一級(jí)分解速率常數(shù))。分解動(dòng)力學(xué)方程和參數(shù)見(jiàn)表4。根據(jù)此方程計(jì)算的理論值與實(shí)測(cè)值符合情況見(jiàn)表4。

表4 不同保存條件下血液中安定分解動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表5 20℃、4℃、-20℃條件下血液中安定理論值與實(shí)測(cè)值比較

3 結(jié) 論

苯駢二氮雜卓類(lèi)藥物在生物檢材中的穩(wěn)定性視母體藥物及其代謝物的結(jié)構(gòu)、存儲(chǔ)條件和防腐劑的添加有關(guān)[6]。室溫下血液和組織標(biāo)本中安定、氟安定以及氟安定的分解產(chǎn)物N-1-脫羥基氟安定在幾個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的,而安定的分解產(chǎn)物去甲安定不穩(wěn)定[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,保存28 d～56 d時(shí),犬血中安定含量下降至其初始濃度的55.5%～65.9%,保存210 d時(shí)下降至初始濃度的15.2%～25.5%。說(shuō)明安定等苯駢二氮雜卓類(lèi)藥物在全血和血漿中均可分解。

3.1 溫度對(duì)保存血液中安定濃度的影響 溫度對(duì)全血中苯駢二氮雜卓類(lèi)藥物穩(wěn)定性的影響已有研究[8-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,室溫、4℃、-20℃保存210 d犬血中安定含量下降為其初始濃度的15.2%～25.5%,但三個(gè)溫度間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在室溫、4℃、-20℃保存時(shí)溫度對(duì)全血中安定穩(wěn)定性的影響不大。

3.2 防腐劑對(duì)保存血液中安定濃度的影響 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,-20℃添加1%氟化鈉保存28 d～150 d犬血中安定含量顯著高于4℃、-20℃保存犬血中安定濃度,但保存210 d時(shí)各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明抑菌劑對(duì)保存血液樣本安定穩(wěn)定性也有較小影響,可輕度抑制其中安定的分解。這也可能與本研究采用活體采血,血樣細(xì)菌污染少有關(guān)。

3.3 WinNorLin軟件擬合結(jié)果分析 血中平均藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)擬合結(jié)果顯示,保存全血中安定的分解動(dòng)力學(xué)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程,可用 Ct=C1e-αt+C2e-βt表示。用此公式計(jì)算的安定血濃度理論值與實(shí)測(cè)值非常接近,說(shuō)明應(yīng)用血中安定分解動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型和參數(shù),可以推測(cè)血中藥物濃度的經(jīng)時(shí)變化,推斷中毒死亡當(dāng)時(shí)或檢材采集當(dāng)時(shí)尸體或檢材中藥物含量,指導(dǎo)選擇最佳檢材存放條件,正確分析和使用毒物分析結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)證明安定在保存血液樣品中可分解,保存溫度和抑菌劑對(duì)其影響較小。安定中毒案件法醫(yī)學(xué)鑒定中所采血樣應(yīng)于28 d內(nèi)送檢和檢驗(yàn),否則可用其分解動(dòng)力學(xué)方程和參數(shù)推斷中毒死亡或檢材采集當(dāng)時(shí)的血藥濃度。

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