大鼠鈣化血管中蛋白激酶G與鈣調神經磷酸酶信號通路的交互調節作用

苑曉燁 李紹冰 李芳 楊圣俊 曾強

動脈鈣化在組織病理學上分為動脈內膜和動脈中層鈣化。無論哪種鈣化，都會引起血流動力學和機械力學的改變，最終將導致左心室肥大、心肌缺血和心律失常，并增加卒中和猝死的危險。血管鈣化與骨代謝及血管平滑肌細胞(vascular smooth mucle cell，VSMC)表型轉換關系密切。環三磷酸鳥苷依賴的蛋白激酶I(cGMP-dependent protein kinase，PKGI)及鈣調神經磷酸酶(calcineurin，CaN)在參與調節血管平滑肌細胞增殖及骨代謝中發揮重要作用。既往研究發現培養VSMC內NO/PKG信號通路和/CaN信號存在交互調節作用［1］。但是，在血管鈣化中NO-cGMP-PKG I通路與鈣-CaN信號通路之間是否存在交互調節作用，進而影響血管鈣化進程并不完全清楚。本研究旨在探討大鼠血管鈣化過程中NO-cGMP-PKG I通路與鈣-CaN通路之間是否存在交互調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料 華法令、維生素D3購自Sigma公司;環孢霉素A(CsA，Sandimmum)購自Novartis公司;維生素K1為無錫市第七制藥有限公司生產;SD雄性大鼠購自河北醫科大學實驗動物中心，PKGI α-mRNA原位雜交檢測試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司合成，CaNA α mRNA原位雜交檢測試劑盒由天津灝洋生物制品科技有限責任公司合成。

1.2 動物分組及鈣化血管的制備 參照文獻［2］將實驗動物隨機分為對照組、鈣化組、鈣化+CsA組(CsA組)，每組12只。實驗第1 ～8 天，3 組均給予維生素 K115 mg·kg－1·d－1，皮下注射，同時C組另給予CsA 10 mg·kg－1·d－1腹腔注射，A組和B組分別給予等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射;實驗第3天開始，B、C 組另給予維生素 D33 ×105U·kg－1·d－1，皮下注射，持續至實驗第5天，及華法令15 mg/100 g，12 h 1次，皮下注射，持續至第8天，對照組在相同時間給予等量0.9%氯化鈉溶液皮下注射;實驗第9天，所有動物以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后處死。

1.3 標本采集 大鼠處死前12 h禁食不限水，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，將大鼠置于冰盒上，開胸，暴露出心臟，分離胸主動脈，并向下剖開腹部，分離出腹主動脈，從主動脈根部至腹主動脈分叉處剪下主動脈，迅速置于4℃預冷的0.9%氯化鈉溶液中沖洗，直至鹽水清涼，置于有0.1%二乙基焦碳酸酯(DEPC)的多聚甲醛溶液中，經常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，每段血管均勻切片3～4張，分別做HE染色等形態學觀察和免疫組化、原位雜交等檢測。

1.4 HE染色 石蠟切片脫蠟至水;蘇木素染色10 min;自來水沖洗2～5 min;1%的鹽酸酒精分化;自來水沖洗;0.1%的氨水返藍;自來水充分沖洗;0.5%伊紅染色2 min;自來水沖洗;常規梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5 原位雜交測定

1.5.1 PKGI α-mRNA 探針合成序列:①5’-AGACCTACAGGTCCTTCCACGACCTGCGCCAGGCG 3’;②5’-TGATCGACAATGTTTTCAAACAATAATGATGAGAA 3’;③5’-ACACGAGACAGCAGGAGCACATCCGCTCAGAGAAG 3’。步驟:石蠟切片脫蠟至水;置過氧化氫封閉液室溫15 min;切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶;滴加預雜交液;滴加雜交液覆蓋組織44℃濕盒孵育過夜;雜交后的洗滌;滴加封閉液;滴加生物素化鼠抗地高辛;滴加SABC;滴加生物素化過氧化物酶，原位雜交用PBS洗;DAB顯色，蘇木素復染;常規梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5.2 CaN Aα-mRNA 探針合成序列:①5’-CGGTG ACTTG GCGGA AATGG AACGG CTT;②5’-AAGAA GAGGT AGCGA GTGTT GGCAG GAG;③5’-CGAAG GCATC CATAC AGGCG TCATA AAC。探針①、②和③混合標記地高辛。步驟:石蠟切片脫蠟至水;置打孔液中室;置過氧化氫封閉液室溫20 min，0.01 mol/L PBS沖洗3次;滴加復合消化工作液室，0.01 mol/L PBS沖洗3次，0.2×ssc(標準檸檬酸鹽溶液)洗1次;滴加預雜交工作液覆蓋組織37℃濕盒孵育1 h;預雜交后的洗滌;滴加雜交工作液覆蓋組織42℃濕盒孵育過夜;雜交后的洗滌;滴加大鼠抗地高辛生物素標記的抗體工作液，覆蓋組織37℃濕盒孵育45 min，0.01 mol/L PBS沖洗3次;滴加高敏過氧化物酶鏈親和素復合物工作液;DAB顯色，蘇木素復染;常規梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.6 主動脈組織ALP活性測定 按照試劑盒說明書操作。定義每克組織蛋白(gprot)在37℃與基質作用15 min產生1 mg酚為1單位。計算公式為:組織ALP活性(U/gprot)=(測定管吸光度 OD值/標準管吸光度 OD值 ×標準管酚含量(0.003 mg)/取樣量中的蛋白克數。

1.7 將原位雜交結果 應用Image-Pro Plus圖象分析軟件，分別計算各組主動脈組織相同面積內陽性細胞的累積光密度值(integrated optic density，IOD)。

1.8 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，對計量資料進行正態性檢驗及方差齊性檢驗，組間資料比較應用單因素方差分析，兩兩比較應用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色 結果顯示對照組大鼠主動脈壁結構完整，中層血管平滑肌細胞(VSMCs)排列整齊(圖1);鈣化組大鼠主動脈中層VSMCs排列紊亂，彈力纖維迂曲斷裂(圖2);CsA組大鼠主動脈中層VSMCs亦排列紊亂，彈力纖維層迂曲斷裂(圖3)。

2.2 原位雜交 3組大鼠主動脈可見 CaN Aα mRNA及PKGIα mRNA表達，主要位于胞漿中。見圖4～6。鈣化組與對照組比較:鈣化組大鼠主動脈CaN Aα mRNA較對照組表達明顯增加(P＜0.01)，PKGIα mRNA較對照組表達明顯減少(P＜0.01);CsA組與對照組比較:CsA組大鼠主動脈CaNAα mRNA較對照組表達明顯增加(P＜0.01)，PKGIα mRNA較對照組表達明顯增加(P＜0.01);CsA組與鈣化組比較:CsA組大鼠主動脈CaN Aα mRNA與鈣化組比較表達明顯減少(P＜0.01)，PKGIα mRNA 較鈣化組表達明顯增加(P＜0.01)。見表1。

表1 原位雜交結果及主動脈組織ALP活性測定n=6，

表1 原位雜交結果及主動脈組織ALP活性測定n=6，

注:與對照組比較，*P＜0.01;與鈣化組比較，#P＜0.05，△P＜0.01

組別 CaN A αmRNA(IOD)PKGIα mRNA(IOD) ALP(U/gprot)對照組 10302±2636 8713±740 360±49鈣化組 26421±1698* 5774±643* 463±65*CsA組 16775±4030# 11044±972# 480±75#

2.3 ALP活性 鈣化組ALP活性(463±65)U/gprot較對照組(360±49)U/gprot增加(P＜0.05);CsA組ALP活性(480±75)U/gprot較對照組(360±49)U/gprot明顯增加(P＜0.01)，CsA組ALP活性(480±75)U/gprot與鈣化組(463±65)U/gprot比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。

3 討論

以往認為血管鈣化是衰老時出現的異位骨化，是血管疾病終末期所出現的變性表現，是鈣鹽在細胞內和細胞外基質的被動沉積。然而新近的許多研究發現，血管鈣化并不是磷酸鈣結晶在血管壁的簡單而被動的沉積，而是鈣鹽沉積在細胞內(細胞內鈣超載)和細胞外基質的復雜的、主動的、并且可能是高度可調的過程，類似于骨和軟骨形成過程中的骨化。

本研究鈣化血管中，大鼠主動脈PKGIα mRNA表達減少，CaN Aα mRNA表達增加，推測PKG影響CaN的表達。近年證實血管鈣化是一個受調控的、類似于骨形成的主動過程，鈣化的動脈有成骨細胞和破骨細胞，鈣化的基質被骨基質取代，有新生血管侵入［3，4］。在骨組織，CaN、PKG 是破骨細胞發育必需的［5］，有研究證實CaN、PKG還參與成骨細胞分化及成骨作用［6－8］，CaN及PKG很可能通過成骨相關機制參與調節血管鈣化。VSMCs能夠向成骨細胞表型轉化，是血管鈣化的細胞學基礎之一。研究證明CaN及PKG參與調節VSMCs分化，在血管成形術后再狹窄［9，10］及新生內膜形成中［11，12］具有重要作用。CaN、PKG很可能也參與VSMCs向成骨細胞轉化和鈣化。另外，血管鈣化與 VSMCs凋亡密切相關［13，14］。CaN、PKG 參與 T淋巴細胞、心肌細胞等多種細胞的凋亡，CaN很可能參與VSMCs的凋亡。CaN信號通路在VSMC增殖及功能維持中起到重要作用。胞內Ca2+濃度控制著不同的細胞功能，包括基因表達、增殖、凋亡、粘附和遷移等，CaN可通過其去磷酸化作用調節Ca2+通道、影響胞內Ca2+濃度、參與VSMC增殖等功能活動的調控。一氧化氮(nitric oxide，NO)能夠激發多種信號傳導通路，刺激可溶性鳥苷環化酶催化細胞內cGMP合成，再由cGMP激活PKG調節局部和全身信號等。同時NO通過抑制肌漿網IP3受體和雷尼丁受體釋放Ca2+，以及介導cGMP和PKG抑制N型鈣通道Ca2+內流，調節平滑肌細胞內鈣離子濃度。PKG是廣泛存在于真核細胞內的一種絲(蘇)氨酸蛋白激酶，存在于多種組織細胞，是重要的信號分子NO的下游底物，能夠在多種水平調節Ca2+水平，從而參與多種細胞功能調節。Fiedler等［15］發現PKG激活后可以抑制Ca2+從L型鈣通道進入胞質，可以抑制CaN-NAFT信號通路，從而減少心肌細胞體積。故推測，在血管鈣化過程中，PKG可通過Ca2+的濃度變化影響CaN的表達。

圖1 對照組大鼠主動脈HE染色(HE×400)

圖2 鈣化組大鼠主動脈HE染色(HE×400)

圖3 CsA組大鼠主動脈HE染色(HE×400)

圖4 對照組PKGⅠα mRNA表達(HE×400)

圖5 鈣化組PKGⅠα mRNA表達(HE×400)

圖6 CsA組PKGⅠα mRNA表達(HE×400)

本實驗給予CaN抑制劑CsA后，鈣化血管中CaN Aα mRNA表達減少，而PKG Iα mRNA的表達及鈣化的標志物ALP卻有增加的趨勢，推測CaN抑制鈣化血管中PKG Iα的表達。其機制可能為:CaN介導的脫磷酸化和核轉位作用在信號傳導途徑中是一中樞性事件。它不僅本身可介導多條信號傳導通路，而且通過其去磷酸化作用可對其他信號通路進行調節，使Ca2+信號與其他第二信使的調節機制發生“交談”，協同調節細胞的功能。在鈣化血管中CaN激活，使受磷蛋白(phospholamban，PLB)去磷酸化而活化，PLB能夠抑制肌漿網鈣-ATP酶(SERDA2a)的活性，從而減少肌漿網對胞漿內Ca2+的重吸收，使細胞漿內Ca2+水平升高，上調一氧化氮合酶活性，NO水平增加，繼而生成大量cGMP，激活蛋白激酶A，抑制PKG Iα表達［16］。當用特異性抑制物CsA阻斷CaN活性后，上述過程被抑制，從而使PKG Iα表達明顯增加。

本研究結果提示，培養鈣化血管內NO/PKG信號通路和Ca2+/CaN信號存在交互調節作用。血管鈣化可以引起血流動力學和機械力學的改變，動脈管壁僵硬，收縮壓升高、舒張壓降低，脈壓差增大，冠狀動脈灌注降低，最終將導致左心室肥大、心肌缺血和心律失常，并增加卒中和猝死的危險［17，18］。已經證實CaN-NFAT信號通路是促進細胞肥大重要調節者，明確CaN與PKG I之間的相互關系有助于了解血管鈣化的可能發病機制，并為抗血管鈣化的藥物治療提供了可能的新途徑。

1 孫寧玲，馬旃，李世軍.血管平滑肌細胞增殖中蛋白激酶G與鈣調磷酸酶信號通路的交互調節.中國動脈硬化雜志，2006，14:645-648.

2 Price PA，Faus SA，Williamson MK.Warfarin-induced artery calcification is accelerated by growth and vitamin D.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2000，20:317-327.

3 Johnson RC，Leopold JA，Loscalzo J.Vascular calcification pathobiological mechanisms and clinical implications.Circ Res，2006，99:1044-1059.

4 Shao JS，Cai J，Towler DA.Molecular mechanisms of vascular calcification lessons learned from the aorta.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26:1423-1430.

5 Sun L，Peng YZ，Zaidi N，et al.Evidence that calcineurin is required for the genesis of bone-resor-bing osteoclast.Am J Physiol Renal Physiol，2007，292:F285-F291.

6 Sun L，Blair HC，Peng Y，et al.Calcineurin regulates bone formation by the osteoblast.PNAS，2005，102:17130-17135.

7 Winslow MM，Pan M，Starbuck M，et al.Calcineurin/NFAT signaling in osteoblasts regulates bone mass.Dev Cell，2006，10:771-782.

8 Chikuda H，Kugimiya F，Hoshi K，et al.Cyclic GMP-dependent protein kinase II is a molecular switch from proliferation to hypertrophic differentiation of chondrocytes.Genes Dev，2004，18:2418-2429.

9 Yu HX，Sliedregt-bol K，Overkleeft H，et al.Therapeutic potential of a synthetic peptede inhibitor of nuclear factor of activated T cells as antirestenotic agent.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26:1531-1537.

10 Doi K，Ikeda T，Itoh H，et al.C-type natriuretic peptide induces redifferentiation of vascular smooth muscle cells with accelerated reendothelialization.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001，21:930-936.

11 Takeda R，Suzuki E，Takahashi M，et al.Calcineurin is critical for sodium-induced neointimal formation in normotensive and hypertensive rats.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，294:H2871-H2878.

12 Sinnaeve P，Chiche JD，Gillijns H，et al.Overexpression of a constitutively active protein kinase G mutant reduces neointima formation and in-stent reste-nosis.Circulation，2002，105:2911-2916.

13 Shroff RC，Mcnair R，Figg N，et al.Dialysis accelerates medial vascular calcification in part by triggering smooth muscle cell apoptosis.Circulation，2008，118:1748-1757.

14 Clarke MCH，Littlewood TD.Figg N，et al.Chronic apoptosis of vascular smooth muscle cells accelerates atherosclerosis and promotes calcification and medial degeneration.Circ Res，2008，102:1529-1538.

15 Fiedler B，Lohmann SM，Smolenski A.Inhibition of calcineurin-NFAT hypertrophy signalingby cGMP-dependentproteinkinase type I in cardiac myocytes.PNAS，2002，99:11363-11368.

16 Pilz RB，Casteel DE.Regulation of gene expression by cyclic GMP.CircRes，2003，93:1034-1046.

17 Raggi P，Bellasi A.Clinical assessment of vascular calcification.Adv Chronic Kidney Dis，2007，14:37-43.

18 EI-Abbadi M，Giachelli CM.Mechanisms of vascular calcification.Adv Chronic Kidney Dis，2007，14:54-56.