血管緊張素原基因M235T多態(tài)性與下肢深靜脈血栓的關(guān)系

石曉明 吳勝春 呂柏南

血管緊張素原(AGT)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)中的唯一初始底物，血漿中AGT水平的高低，直接影響著RAS活性的強(qiáng)弱，近來(lái)研究的焦點(diǎn)多集中在其與原發(fā)性高血壓、心肌梗死的關(guān)系上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AGT基因外顯子2中M235T(235位氨基酸由蘇氨酸代替蛋氨酸)多態(tài)與原發(fā)性高血壓、心肌梗死有關(guān)［1－3］。本文研究了M235T在下肢深靜脈血栓(DVT)患者中的分布情況，為該位點(diǎn)與疾病的相關(guān)性研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2004年11月至2009年5月于我科就診的DVT患者72例(DVT組)，其中男40例，女32例;年齡25～84歲，平均年齡(52±9)歲。對(duì)照組為我院門(mén)診健康體檢者80例，其中男44例，女36例;年齡28～65歲，平均年齡(47±8)歲。DVT患者除臨床表現(xiàn)外，均有血管超聲或深靜脈造影等影像學(xué)證據(jù)予以證實(shí)。2組檢測(cè)血、尿、便常規(guī)、心電圖、B超未發(fā)現(xiàn)異常，均除外高血壓、心血管病、慢性肝病、糖尿病、糖尿病腎病等慢性?xún)?nèi)科疾病，排除應(yīng)用影響凝血功能藥物者。2組一般資料具有均衡性。

1.2 方法 抽取空腹外周靜脈血3 ml，EDTA抗凝，－80℃低溫冰箱保存，用于提取DNA。用常規(guī)酚/氯仿方法提取DNA，進(jìn)行目的基因片段聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)(RFLP)分析。AGT基因引物序列參照Russ等［4］的設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。序列為5’-CGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTC-3’，5’-AGGGTGCTGTCCACACTGGACCC-3’(AC為非配對(duì)堿基)。當(dāng)在A(yíng)GT基因外顯子2核苷酸704處T轉(zhuǎn)變成C，并不改變限制性位點(diǎn)，但產(chǎn)生一個(gè)適合被Tth111Ⅰ(GACNNNGTC)酶切的“半位點(diǎn)”，另一個(gè)“半位點(diǎn)”的引入是通過(guò)存在兩個(gè)非配對(duì)堿基(下劃線(xiàn))的PCR引物來(lái)完成。兩個(gè)非配對(duì)堿基不干擾PCR的延伸。反應(yīng)總體積為30 μl，將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓 80 V，時(shí)間40 min，PCR Marker作參照，紫外燈下觀(guān)察結(jié)果。取PCR產(chǎn)物1 μl加入內(nèi)含5 U Tth111Ⅰ限制性?xún)?nèi)切酶(Promega公司)的12 μl緩沖液體系中，65℃水浴，消化 4 h。取酶切后產(chǎn)物10 μl，配制8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行垂直電泳，電壓200 V，電泳40 min。10%乙醇 +0.5%冰醋酸固定，0.2%硝酸銀染色，0.75%氫氧化鈉+0.2%甲醛顯色。電泳結(jié)果分型:AGT基因M等位基因純合型(235MM型)因無(wú)酶切位點(diǎn)，顯示一條163 bp的擴(kuò)增片段;AGT基因T等位基因純合型(235TT型)因在外顯子2核苷酸704處T變成C，故可被Tth111Ⅰ酶切，產(chǎn)生一條新的140 bp的片段;AGT基因M235T雜合型(235MT型)則同時(shí)具有163 bp和140 bp兩種片段。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

DVT組中，235TT型為50例，235MT型為18例，235MM型為4例;對(duì)照組分別為42、30、8例。DVT組TT基因型頻率為69.4%，高于對(duì)照組52.5%(χ2=4.554，P＜0.05)。DVT 組 T等位基因頻率為81.9%，高于對(duì)照組的71.3%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組AGT基因型及等位基因頻率的分布 例(%)

3 討論

DVT形成是臨床常見(jiàn)的周?chē)o脈病變，其形成深靜脈血栓的三大因素為血流滯緩、靜脈壁損傷、血液高凝狀態(tài)，若治療不及時(shí)，血栓蔓延，易并發(fā)肺栓塞，從而危及生命［5］。流行病學(xué)研究表明嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的心肌梗死、腦梗死、肺栓塞等疾病的發(fā)生和發(fā)展均與血栓形成有著密切的關(guān)系，因此對(duì)血栓的研究已成為熱門(mén)課題。

國(guó)內(nèi)外對(duì)血栓形成性疾病的研究主要集中于凝血、纖溶、RAS基因的多態(tài)性等方面。AGT是 RAS的重要組成成分之一，是生成具有高生物活性的血管緊張素的基底物質(zhì)，具有強(qiáng)烈的舒縮血管活性，能影響體內(nèi)血壓調(diào)節(jié)和水鹽平衡。AGT基因位于1q42-43處，編碼區(qū)由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。Jeunemaitre等［6］對(duì) AGT所有外顯子和 5’非編碼區(qū)的一個(gè)682 bp片段進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)15個(gè)明顯的分子變異，其中2號(hào)外顯子704核苷酸處胸腺嘧啶(T)被胞嘧啶(C)所代替，導(dǎo)致編碼產(chǎn)物第235號(hào)氨基酸由蛋氨酸(Met)變?yōu)樘K氨酸(Thr)，由此產(chǎn)生三種基因型:無(wú)突變M等位基因純合型(235MM型)，雜合型(235MT型)，有突變T等位基因純合型(235TT型)。

目前對(duì)AGT多態(tài)性的研究多集中于原發(fā)性高血壓和心肌梗死。Jeunemaitre等［6］對(duì)高加索人的研究中發(fā)現(xiàn)，心肌梗死患者中AGT TT基因型比對(duì)照者高。在對(duì)原發(fā)性高血壓患者研究中亦發(fā)現(xiàn)AGT基因與高血壓關(guān)系密切［7］，且不同AGT基因型的高血壓患者血漿中AGT濃度不同。但也有研究顯示AGT與高血壓無(wú)關(guān)［8］。本研究結(jié)果表明，DVT患者中TT基因型頻率69.4%高于對(duì)照組52.5%(P＜0.05)，T 等位基因頻率81.9%高于對(duì)照組71.3%(P ＞0.05)，提示TT基因型與DVT明顯相關(guān)，AGT多態(tài)性為DVT的風(fēng)險(xiǎn)提示因子，因此檢測(cè)AGT基因型，可以預(yù)先提示某些人有患DVT的趨勢(shì)，據(jù)此采取某些預(yù)防措施，降低DVT的發(fā)病率，達(dá)到早期防治MI的目的。但DVT發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，同時(shí)基因表達(dá)與種族、民族、地域、血緣等因素均有關(guān)系，其具體情況尚待進(jìn)一步研究。

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