膽總管結扎誘發大鼠肝外膽汁瘀積的肝腎功能動態變化研究

朱平生，王 兵，龍愛華

(1.河南中醫學院肝病研究所，河南 鄭州 450008;2.上海中醫藥大學肝病研究所，上海 201203)

膽總管結扎(BDL)模型是成熟的肝外膽汁瘀積模型[1]。本文參考國外文獻[2]，建立大鼠肝外膽汁瘀積模型，對該模型形成過程中的肝、腎功能進行動態觀察，分析探討其特點，為進一步應用此模型開展藥理學研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 動物

Wistar雄性大鼠50只，清潔級，體重200 g±20g，中國科學院上海實驗動物中心，SCXK(滬)2006-0012，上海中醫藥大學實驗動物中心飼養、造模和觀察。

1.2 試劑

肝、腎功能試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 模型復制及動態觀測

按數字表隨機法將大鼠分為2組，模型組38只，假手術組12只，大鼠禁食不禁水12h后，腹部皮膚常規消毒，用2%戊巴比妥鈉以2ml/kg體重劑量大鼠腹腔注射麻醉，沿腹正中線切開，暴露并游離膽總管，將膽總管遠近端三段結扎，于遠心端第2、3結扎線之間剪斷膽總管并關腹。假手術組僅開腹并游離膽總管后關腹[2]。于大鼠膽總管結扎第3天及1周、2周分別隨機取模型組5只、假手術組3只大鼠處死取材，于3周處死剩余大鼠取材，觀測肝重、脾重、體重。

1.4 樣品采集及處理

經2%戊巴比妥鈉以2ml/kg體重劑量腹腔麻醉后，大鼠仰臥位固定，打開腹腔觀察大體情況和肝、脾的色、質、形態、體積及腹水情況。經下腔靜脈采血并分離血清備用，摘取肝、脾稱重。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 一般情況 體重、肝重、脾重等。

1.5.2 肝、腎功能 檢測血清 AlB、GLO、TP、TBil、TBA、CHO、BUN、CRE 含量，ALT、AST、LDH、ALP、GGT活性，按試劑盒說明方法測定。

1.6 統計學方法

計量資料用統計分析軟件SPSS13.0中ANOVA程序進行單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結果

2.1 一般狀況

自造模開始觀察至3周末，模型組死亡12只，死亡率為24%，動物在第1周內死亡較多，2～3周死亡減少。

表1顯示，與假手術組比較模型組大鼠的體重都有不同程度的降低，肝重、脾重、肝指數、脾指數呈增高的動態變化。

2.2 肝腎功能的動態變化

表2～4顯示，AlB含量在造模3d后即顯著下降，隨著造模時間的推移呈梯級進行性降低;GLO、TP含量造模3d后先增高并持續在一個水平，于第3周開始下降;TBil含量和 GGT、ALP活性呈持續增高的動態變化，ALT活性和 TBA、CHO含量在造模3d后即顯著增高，此后有所下降，至3周末仍高于假手術組(P<0.01，P<0.05)，AST在 3d后即顯著增高并維持至3周末。LDH活性在造模1周時顯著增高，其后有所下降;BUN含量在造模后前2周無明顯改變，至第3周有所增高，CRE含量無統計學意義。

表1 大鼠一般情況各指標變化情況(s)

表1 大鼠一般情況各指標變化情況(s)

注:與各相同時相的假手術組比較:#P<0.05

組別 n 體重(g)肝重(g)脾重(g)肝指數(%)脾指數(‰)假手術組3天 3 247.33± 2.52 9.77±0.38 0.63±0.06 3.95±0.192.6±0.2假手術組1周 3 255.67± 4.04 10.40±1.22 0.67±0.06 4.07±0.48 2.6±0.2假手術組2周 3 295.67± 9.71 9.60±1.25 0.70±0.10 3.24±0.33 2.4±0.2假手術組3周 3 306.40±13.43 10.49±0.63 0.68±0.09 3.42±0.08 2.2±0.2模型組3天 5 203.60±29.69# 12.00±1.00# 1.16±0.13# 5.95±0.51# 5.8±0.9#模型組1周 5 190.00±34.00# 12.12±1.54# 1.28±0.64# 6.43±0.41# 6.6±2.4#模型組2周 5 218.40±10.43# 13.20±1.30# 1.34±0.13# 6.05±0.63# 6.1±0.6#模型組3周 11 210.17±23.60# 13.78±2.39# 1.55±0.41# 6.55±0.80# 7.4±1.9#

表2 大鼠血清AlB、GLO、TP、TBil含量變化表(s)

表2 大鼠血清AlB、GLO、TP、TBil含量變化表(s)

注:與假手術組比較:#P<0.05，*P<0.01;與模型其他時間點比較:△P<0.05

組 別 n ALB(g/L)GLO(g/L)TP(g/L)TBil(μmol/L)假手術組 12 32.72±1.29 24.29±3.24 57.01± 4.23 8.44±7.39 3天模型組1周2周3周29.02±4.36*29.70±0.60*27.92±3.57*22.93±1.62*△33.68±3.89#30.53±0.84#36.24±7.69#26.6±3.75#△62.70±7.62#60.23±0.40#64.16±11.13#49.53± 4.96#△81.32±8.47*83.00±10.43*92.36±15.00*141.87±53.20*△

3 討論

膽管結扎形成的膽汁瘀積，在3周內模型大鼠肝臟重量逐漸增加，可能與造模后肝臟膽管上皮細胞增生有關。膽管結扎后大鼠血清白蛋白含量隨著時間的推移呈進行性降低;球蛋白含量在造模后3d即有增高，是膽管結扎膽汁瘀積球蛋白反應性的增高，在第3周有所下降，與肝細胞的適應性有關;總蛋白先增高后降低的變化是由于造模后3d球蛋白的增高而增高，到第3周時隨著球蛋白和白蛋白的下降而下降。血清膽紅素在結扎后3d驟然增高，后持續緩慢增高，表明在肝細胞發生腫脹、變性、壞死到一定程度后，代償失衡肝內的膽汁瘀積通過膽紅素表現出來，并明顯增高，隨后在肝臟強大的代償功能轉化下，膽紅素量反應鈍化，與膽汁瘀積加重相關性不明顯[3]。ALT及AST活性是監測肝炎的敏感指標，當肝臟發生炎癥、壞死時，ALT、AST就會從肝細胞內大量釋放入血，導致血清中ALT、AST升高。本實驗結果是ALT活性3d時最高，其后下降，可能與肝細胞通透性瞬間的增加相關;AST-直維持在較高水準上與肝細胞的細胞器損傷相關。血清ALP的增高程度與膽管阻塞的程度有關;GGT進行性增高主要表明膽管細胞的病變，亦有認為與肝纖維化的程度有關。在肝外膽汁瘀積時，肝臟產生的膽固醇過多，由于排泄障礙而反流入血液[4]，因此在膽管結扎3d時膽固醇增高，隨著膽汁瘀積加重，肝實質細胞的減少，膽固醇酯化減少，血清內膽固醇比例可有所下降;而膽汁酸是在肝細胞微粒體內由膽固醇轉變而來，與膽汁一起排泄入腸道，是肝臟清除體內膽固醇的主要方式，膽汁酸在造模3d的顯著增高與膽固醇含量的增高有關，后由于膽固醇含量的降低，膽汁酸的量有所下降。

表3 大鼠血清酶ALT、AST、LDH、ALP、GGT活性變化表(s)

表3 大鼠血清酶ALT、AST、LDH、ALP、GGT活性變化表(s)

注:與假手術組比較:*P<0.01;與模型上一時間點比較:△P<0.05，▲P<0.01

組 別 n ALT(U/L)AST(U/L)LDH(U/L)ALP(U/L)GGT(U/L)假手術組 12 39.09± 5.49 218.49± 55.86 1134.57±301.05 109.56± 28.49 4.69± 0.51模型組3天 5 406.80±168.60*△ 777.74±271.95* 2204.18±456.72* 399.68±113.74* 19.44± 4.74*△1周 5 157.47± 81.83* 801.07±590.45*△ 2916.67±697.98*△ 325.47± 53.87*△ 40.53±24.57*2周 5 114.48± 48.16* 507.58±170.11* 1503.84±487.82▲ 287.34±108.66*△ 58.44±25.97*3周 11 172.40± 37.29* 709.90±226.90* 2169.96±434.10*△ 449.13±109.17*△ 144.67±32.19*△

表4 大鼠TBA、CHO、BUN、CRE含量變化表(s)

表4 大鼠TBA、CHO、BUN、CRE含量變化表(s)

注:與模型組比較:#P<0.05，*P<0.01;與模型上一時間點比較:△P<0.05，▲P<0.01

組 別 n TBA(μmol/L)CHO(mmol/L)BUN(mmol/L)CRE(μmol/L)假手術組 12 22.46±11.71* 1.37±0.15* 7.29±1.61#22.73±13.64 23.5±2.19模型組3d 5 362.74±150.89▲ 5.29±1.15△ 7.09±1.84 12.26± 5.06 1w 5 156.37± 29.92 2.86±0.49 6.35±2.85 20.07± 8.29 2w 5 155.66± 53.64 2.03±0.33 6.04±1.02 19.76±12.06 3w 11 255.77±112.79 3.18±2.02 10.98±3.59△

從以上研究可以看出，BDL模型組大鼠的肝腎功能顯著異常，與假手術組比較，模型組TP、ALB含量顯著降低(P<0.05)，TBil、TBA、CHO、BUN 含量，ALT、AST、LDH、ALP、GGT 活性顯著增高(P<0.05，P<0.01)，說明肝外膽汁瘀積可明顯損害肝腎功能。

[1]尹珊珊，王寶恩，王泰齡，等.膽管阻塞性肝纖維化模型的建立與改進[J].中華肝臟病雜志;2002，10(5):385-386.

[2]Yaping Liu，Jane Binz，Mary Jo Numerick，et al.Hepatoprotection by the farnesoid X receptor agonist GW4064 in rat models of intra-and extrahepatic cholestasis[J].J Clin Investigation，2003，112:1678-1687.

[3]劉鉞，張朝明，郝玲，等.血清總膽紅素、甘氨膽酸、甲胎蛋白、糖類抗原19-9與膽汁瘀滯相關性評價[J].國際放射醫學核醫學雜志，2006，30(2):107-109.

[4]姚光弼，范上達，廖家杰.臨床肝臟病學[M].上海:上海科學技術出版社，2004.144.