單核細胞誘導同種異體血管內皮細胞產生干擾素誘導T細胞α型趨化因子的作用機制

高慶貞 朱彬 姬凌飛 王小平 任萬軍 徐何

受者免疫細胞向移植物的趨化和粘附是排斥反應過程的早期步驟，趨化因子在此過程中發揮重要作用。移植物血管內皮細胞(vascular endothelial cell，VEC)是供、受者之間的最早接觸部位，能產生多種趨化因子，在排斥反應中具有重要意義。干擾素誘導蛋白10(interferon-inducible protein 10，IP-10)和干擾素誘導的T細胞α型趨化因子(interferoninducible T-cell alpha chemoattractant，I-TAC)屬于趨化因子CXC亞家族。在發生急性排斥反應時，移植物中IP-10和I-TAC的表達會明顯升高［1-2］。目前對于上述趨化因子生成的機制尚不明確。我們通過體外實驗，觀察單核細胞和VEC共培養后上清液中趨化因子濃度的變化，并研究 TNF和核因子(nuclear factor，NF)-κB細胞信號通路在其過程中的作用，以探討同種異體移植后IP-10和I-TAC生成的機制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

重組人TNF以及抗TNF抗體購自美國R＆D systems公司。NF-κB通路阻斷劑BAY11-7082購自Calbiochem公司。FBS牛膠質、胰酶和VEC生長因子購自Sigma公司。Multiplex試劑盒從Upstate公司獲得。分離純化單核細胞用的Ficoll來自Sigma公司，Percoll來自 Amersham公司。

1.2 VEC分離和培養

所有涉及人體組織的研究均通過醫院倫理委員會和審查委員會審核批準。主動脈與膠原酶在37℃培養箱內培養后消化分離VEC。用RPMI 1640培養液洗滌1次，在M199培養液(含青霉素、鏈霉素各100單位、10%FBS、150 mg/L的VEC生長因子)中進行原代培養。待細胞長滿80%～90%，消化傳代，選用2～4代細胞。流式細胞儀檢測vW因子的陽性率大于95%。

1.3 單核細胞分離、純化和鑒定

取肝素化健康志愿者外周血，Ficoll密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞。用不含鈣離子和鎂離子的PBS洗滌3次，稀釋到2×1010個/L后與Percoll細胞分離液均勻混合，常溫下半徑10 cm，2800 r/min，離心30 min分離淋巴細胞和單核細胞。流式細胞儀檢測單核細胞CD14表達判定細胞純度＞95%。收集單核細胞，用含20%FBS的M199培養液調整細胞至1×109/L備用。

1.4 VEC與單核細胞共培養

VEC以5×105/孔加入6孔培養板，培養24 h后形成細胞單層。在VEC培養液中加入終濃度為10 μg/L 的 TNF，24 h 后取上清液檢測 IP-10、I-TAC濃度，觀察外源性TNF對VEC活化作用。另取吸除內皮細胞的培養基，加入制備的單核細胞懸液2×106個進行共培養，在24、48、72 h取培養上清液檢測 TNF、IP-10、I-TAC 水平。

1.5 抗TNF抗體和BAY11-7082干預

在VEC和單核細胞共培養體系中，加入終濃度為1 mg/L的抗TNF抗體，在共培養24、48、72 h后，取細胞培養上清液和細胞檢測細胞因子濃度和mRNA水平。用二甲基亞砜溶解NF-κB通路阻斷劑BAY11-7082，在VEC培養液中加入10 mg/L BAY11-7082，置37℃的培養箱內培養12 h，然后洗滌VEC培養液3次清除BAY11-7082。BAY11-7082處理后的VEC加入單核細胞進行共培養。

1.6 細胞因子檢測

取細胞培養上清液，加入到Upstate公司提供的培養板中，每份標本設為雙孔，按照產品說明書進行操作，最后使用Multiplex檢測系統測定上清液中TNF、IP-10、I-TAC的水平，并根據標準曲線自動計算細胞因子的濃度。

1.7 細胞因子基因表達檢測

采用實時定量PCR技術測定單核細胞和VEC共培養前后TNF、IP-10、I-TAC基因表達水平。將細胞和Trizol試劑/肝糖RNA試劑分離液混合后，按照標準方法提取RNA。按照反轉錄試劑盒(美國羅氏公司產品)說明書進行操作，將RNA轉換為cDNA。將cDNA標本100 ng均勻地加入到96孔檢測板中，實時PCR檢測每一孔中含有針對特異靶目標的上下游引物(900 nmol)和6-FAM(熒光標記物)標記的探針，用于內部對照的標本為18s核糖體(100 ng)、上下游引物及其VIC(熒光標記物)標記的探針(美國Applied Biosystems公司產品)。使用Applied Biosystems公司產7300型定量PCR儀進行檢測和結果分析。

1.8 統計學處理

數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，統計學處理用SPSS 13.0軟件完成。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外源性TNF對VEC產生IP-10、I-TAC的作用

加入終濃度為10 μg/L的TNF后VEC快速大量產生IP-10、I-TAC，24 h后培養液中 I-TAC、IP-10的濃度顯著升高(P＜0.01)，見表1。

表1 外源性TNF對VEC產生IP-10、I-TAC的影響(±s，ng/L)

表1 外源性TNF對VEC產生IP-10、I-TAC的影響(±s，ng/L)

注:與VEC培養液比較*P＜0.05。TNF，腫瘤壞死因子;VEC，血管內皮細胞;IP-10，干擾素誘導蛋白10;I-TAC，干擾素誘導的T細胞α型趨化因子

I-TAC VEC 培養液 30.2 ±2.4培養體系 IP-10 40.7 ±4.3 TNF+VEC 培養液 7856.0 ±350.8* 1395.0 ±97.3*

2.2 VEC和單核細胞共培養對TNF產生的影響

在單核細胞、VEC單獨培養的上清液中，TNF的濃度很低，培養72 h后分別為(0.60±0.24)ng/L和(3.40±0.54)ng/L。當單核細胞和同種異體VEC共培養72 h后，上清液中TNF濃度明顯升高，達到(64.6±6.9)ng/L，與單獨培養差異均有統計學意義(均 P ＜0.01)。

2.3 VEC 和單核細胞共培養后 TNF、IP-10、I-TAC基因表達變化

與共培養前的單核細胞和VEC的混合細胞相比，共培養24、48 h后細胞上清液中 TNF、IP-10、ITAC基因均呈現明顯上調;共培養72 h后，IP-10、ITAC基因表達仍維持在高水平，而TNF基因表達開始下降，見表2、圖1。

表2 VEC和單核細胞共培養后TNF、IP-10、I-TAC mRNA相對表達量變化(±s)

表2 VEC和單核細胞共培養后TNF、IP-10、I-TAC mRNA相對表達量變化(±s)

注:表中的數據為相對于共培養前單核細胞和VEC混合細胞中各因子基因的倍增量。VEC，血管內皮細胞;TNF，腫瘤壞死因子;IP-10，干擾素誘導蛋白10;I-TAC，干擾素誘導的T細胞α型趨化因子

共培養時間(h)TNF IP-10I-TAC 24 3.5 ±0.6 12 ±1.3 7.9 ±1.2 5.8 ±0.7 48 8.9 ±0.4 33.5 ±2.7 8.7 ±1.0 72 0.57 ±0.03 16.6 ±2.1

圖1 單核細胞和VEC共培養后TNF、IP-10、I-TAC基因表達的變化

2.4 共培養體系IP-10和I-TAC濃度變化以及抗TNF抗體、BAY11-7082對 IP-10和 I-TAC生成的影響

單核細胞或VEC單獨培養時，IP-10和I-TAC濃度均很低，不隨培養時間延長而升高或僅有輕微升高。當單核細胞和內皮細胞共培養24 h后，上清液中IP-10和I-TAC的濃度開始升高;在共培養48和72 h后，上清液中IP-10和I-TAC的濃度明顯升高。而在共培養體系中加入終濃度為1 ng/L的抗TNF抗體后，能消除共培養產生的趨化因子濃度升高(均P＜0.05)現象，見表 3和圖 2;使用 BAY11-7082也能消除趨化因子濃度上升(均P＜0.05)的現象，見表4和圖3。

表3 單核細胞和VEC共培養以及使用抗TNF抗體、BAY11-7082對IP-10生成的影響(±s，ng/L)

表3 單核細胞和VEC共培養以及使用抗TNF抗體、BAY11-7082對IP-10生成的影響(±s，ng/L)

注:與單核細胞+VEC比較*P＜0.05。VEC，血管內皮細胞;TNF，腫瘤壞死因子;IP-10，干擾素誘導蛋白10

共培養時間(h)單核細胞 VEC 單核細胞+VEC 單核細胞+VEC+抗TNF抗體 單核細胞+VEC+BAY11-7082 24 10.3 ±2.3 8.9 ±2.9 27.5 ±3.3 17.8 ±3.8* 27.3 ±3.6*48 20.5 ±3.6 4.3 ±2.6 536.9 ±45.2 50.2 ±10.6* 38.6 ±8.7*72 36.5 ±4.1 9.2 ±2.4 820.6 ±52.9 102.8 ±21.5* 287.1 ±30.9*

表4 單核細胞和VEC共培養以及使用抗TNF抗體、BAY11-7082對I-TAC生成的影響(±s，ng/L)

表4 單核細胞和VEC共培養以及使用抗TNF抗體、BAY11-7082對I-TAC生成的影響(±s，ng/L)

注:與單核細胞+VEC比較*P＜0.05。VEC，血管內皮細胞;TNF，腫瘤壞死因子;I-TAC，干擾素誘導的T細胞α型趨化因子

共培養時間(h)單核細胞 VEC 單核細胞+VEC 單核細胞+VEC+抗TNF抗體 單核細胞+VEC+BAY11-7082 24 2.2 ±0.31 12.8 ±2.5 11.4 ±2.5 7.4 ±1.3* 8.9 ±1.2*48 1.4 ±0.24 13.3 ±1.6 37.3 ±4.3 14.7 ±2.6* 16.1 ±3.1*72 2.1 ±0.36 16.2 ±3.3 77.3 ±5.5 20.8 ±3.9* 30.6 ±1.6*

圖2 單核細胞和VEC共培養以及使用抗TNF抗體、BAY11-7082對IP-10生成的影響

圖3 單核細胞和VEC共培養以及使用抗TNF抗體、BAY11-7082對I-TAC生成的影響

3 討論

器官移植后最早聚集到移植物的免疫細胞是單核細胞，然后發生淋巴細胞的趨化反應［3］。即使術前清除T淋巴細胞，仍然會發生急性排斥反應［4］，而清除受者的單核細胞后則不會發生排斥反應［5］。因此單核細胞在移植免疫早期具有重要意義。體外研究顯示，單核細胞能與同種異體VEC發生高水平的粘附，隨后相互活化，誘導VEC表達HLA-DR以及CD54、CD62等黏附分子［6］。在眾多趨化因子中，IP-10和I-TAC具有強大的趨化效應，能夠誘導T淋巴細胞和NK細胞聚集。研究已明確，T淋巴細胞能刺激同種異體VEC活化并產生IP-10和I-TAC等趨化因子［7］，但單核細胞對上述趨化因子的效果和機制尚不清楚。

在以往的研究中，用實時定量PCR技術檢測VEC和同種異體單核細胞共培養后IP-10和I-TAC mRNA表達情況，結果顯示在共培養24 h后細胞內IP-10和I-TAC mRNA表達水平顯著增加，且48 h和72 h后表達維持在較高的水平［8］。在本實驗中，采用Multyplex技術檢測上清液中兩種趨化因子濃度，結果，單獨培養的單核細胞和VEC上清液中僅能檢測到微量的IP-10和I-TAC，但在共培養24 h后兩種趨化因子的濃度開始升高，48、72 h后明顯升高。這些結果都表明單核細胞和VEC共培養能活化產生IP-10和I-TAC。

單核細胞和VEC的活化反應是直接黏附反應，但同時也需要細胞因子的參與［9］。對T淋巴細胞的研究發現，T淋巴細胞主要通過產生IFN-γ刺激VEC產生IP-10和I-TAC［10］。單核細胞在體內活化后能產生TNF、IL-6、IL-12、IL-18等多種因子，但不包括 IFN-γ。外源性 TNF能刺激 VEC生成CX3CL1等趨化因子［11］;在單核細胞與VEC反應產生細胞間黏附分子-1和血管細胞間黏附分子-1的過程中，TNF也發揮重要作用［12］。為了研究 TNF在IP-10和I-TAC生成過程中的作用，本實驗中首先加入培養液終濃度為10 μg/L的外源性TNF。結果表明，24 h后上清液中IP-10和I-TAC的濃度快速大量升高。這表明外源性TNF是一種強效的刺激因子，能直接刺激VEC生成IP-10和I-TAC。單核細胞、VEC單獨培養時，培養液中TNF濃度都很低;而當兩種細胞共培養后，TNF在基因轉錄水平和表達上都有明顯升高，這表明單核細胞和同種異體VEC共培養能使單核細胞發生活化反應產生TNF。由于單核細胞和VEC的共培養體系中會生成內源性TNF，這些內源性的TNF應該也能導致IP-10和I-TAC生成增加。實驗中對共培養上清液趨化因子的監測結果也證實這一點。而在共培養體系中加入抗TNF抗體后IP-10、I-TAC產量被抑制，這進一步說明 TNF在生成 IP-10、I-TAC過程中的關鍵性作用。

TNF主要通過激活 NF-κB、Caspase蛋白酶、ERK等信號通路產生其多種生物學效應。對于VEC而言，NF-κB途徑在VEC活化生成趨化因子(如單核細胞趨化蛋白-1)以及細胞間黏附分子(如CD54、CD62E、CD62P和 CD106)的過程中發揮重要作用［13］。NF-κB 靜息狀態下與 NF-κB 抑制因子IκBα結合以非活性狀態存在細胞漿中，受到外界刺激活化后，IκBα發生磷酸化降解，NF-κB得以進入細胞核發生作用。應用BAY11-7082可以抑制IκBα 發生磷酸化，阻止 NF-κB 活化［14］。以往的實驗結果表明，BAY11-7082可以阻斷重組人TNF誘導或者 CD40-CD154間反應所誘導的VEC活化［15-16］。本實驗使用10 mg/L的BAY11-7082預處理VEC 12 h，可以抑制共培養導致的IP-10、I-TAC升高。由此可以推斷，在單核細胞與VEC參與的免疫反應中，主要通過NF-κB信號通路刺激VEC產生IP-10、I-TAC等趨化因子。

綜上所述，單核細胞和VEC共培養時，能夠生成IP-10、I-TAC等趨化因子，在此過程中，TNF和NF-κB信號通路發揮重要作用。因此提示同種異體器官移植后，供者的單核細胞聚集到移植物局部，與VEC接觸并活化。單核細胞活化后產生TNF，再進一步通過NF-κB信號通路刺激VEC產生IP-10、I-TAC等趨化因子，參與移植后排斥反應。應用抗TNF抗體或者NF-κB信號通路阻斷劑，能夠抑制單核細胞與VEC免疫反應中IP-10、I-TAC等趨化因子的生成，從而降低器官移植后排斥反應的發生率。

1 Zhao DX，Hu Y，Miller GG，et al.Differential expression of the IFN-gamma-inducible CXCR3-binding chemokines，IFN-inducible protein 10，monokine induced by IFN，and IFN-inducible T cell alpha chemoattractant in human cardiac allografts:association with cardiac allograft vasculopathy and acute rejection［J］.J Immunol，2002，169(3):1556-1560.

2 Panzer U，Reinking RR，Steinmetz OM，et al.CXCR3 and CCR5 positive T-cell recruitment in acute human renal allograft rejection［J］.Transplantation，2004，78(9):1341-1350.

3 Hoffmann SC，Kampen RL，Amur S，et al.Molecular and immunohistochemical characterization of the onset and resolution of human renal allograft ischemia-reperfusion injury［J］.Transplantation，2002，74(7):916-923.

4 Kirk AD，Mannon RB，Kleiner DE，et al.Results from a human renal allograft tolerance trial evaluating T-cell depletion with alemtuzumab combined with deoxyspergualin［J］.Transplantation，2005，80(8):1051-1059.

5 Jose MD，Ikezumi Y，van Rooijen N，et al.Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection［J］.Transplantation，2003，76(7):1015-1022.

6 王小平，劉子棟，朱彬，等.低溫缺氧條件下血管內皮細胞的基因表達及與單核細胞間的相互作用［J］.中華器官移植雜志，2007，28(10):589-594.

7 Raju R，Malloy A，Shah T，et al.Alloimmune induction of endothelial cell-derived interferon-γ-inducible chemokines［J］.Transplantation，2003，75(7):1072-1074.

8 高慶貞，王璞，王琪，等.同種異體單核細胞活化血管內皮細胞產生IP-10、I-TAC的體外研究［J］.山東大學學報(醫學版)，2010，48(6):45-48.

9 Takahashi M，Ikeda U，Masuyama J，et al.Monocyte-endothelial cell interaction induces expression of adhesion molecules on human umbilical cord endothelial cells［J］.Cardiovasc Res，1996，32(2):422-429.

10 Marx N，Mach F，Sauty A，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma activators inhibit IFN-gamma-induced expression of the T cell-active CXC chemokines IP-10，Mig，and I-TAC in human endothelial cells［J］.J Immunol，2000，164(12):6503-6508.

11 Matsumiya T，Ota K，Imaizumi T，et al.Characterization of synergistic induction of CX3CL1/fractalkine by TNF-alpha and IFN-gamma in vascular endothelial cells:an essential role for TNF-alpha in posttranscriptional regulation of CX3CL1［J］.J Immunol，2010，184(8):4205-4214.

12 Funayama H，Ikeda U，Takahashi M，et al.Human monocyte-endothelial cell interaction induces platelet-derived growth factor expression［J］.Cardiovasc Res，1998，37(1):216-224.

13 Zhou Z，Connell MC，MacEwan DJ.TNFR1-induced NF-kappaB，but not ERK，p38MAPK or JNK activation，mediates TNF-induced ICAM-1 and VCAM-1 expression on endothelial cells［J］.Cell Signal，2007，19(6):1238-1248.

14 Ghosh S.Regulation of inducible gene expression by the transcription factor NF-κB［J］.Immunol Res，1999，19(2-3):183-189.

15 朱彬，王璞，劉子棟，等.核轉錄因子-κB通路在CD40-CD154誘導血管內皮細胞活化中的作用［J］.中華器官移植雜志，2008，29(4):204-207.

16 Zhu B，Liu Z，Wang P，et，al.A nuclear factor-kappaB inhibitor BAY11-7082 inhibits interactions between human endothelial cells，T cells，and monocytes［J］. Transplant Proc， 2008，40(8):2724-2728.