疏血通注射液對大鼠隨意型皮瓣存活的影響

林丁盛 張義鵬 鄭鑫 李志杰

隨意型皮瓣因取材方便和靈活而廣泛應用于臨 床組織缺損的修復和重建。但隨意型皮瓣的長寬比一般不超過2∶1。一旦超出該長寬比，皮瓣遠端容易發生缺血壞死，這極大地限制了它在臨床上的應用。如果在增加隨意型皮瓣長寬比例的同時改善皮瓣微循環、增加血運，可保證較高的成活率，對提高臨床隨意型皮瓣的應用范圍有重要意義。疏血通注射液具有抗凝、溶栓、促纖溶、抗血小板聚集、細胞保護等作用。我們研究疏血通注射液對大鼠隨意型皮瓣成活的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及動物

疏血通注射液(批號100403-1)購自牡丹江友搏藥業有限責任公司，小鼠抗大鼠血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體購自美國Santa Cruz公司，山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋公司。健康的Sprague Dawley大鼠24只(由溫州醫學院實驗動物中心提供)，雌雄不拘，體質量150～200 g，2～3個月齡。

1.2 模型制備及分組

將大鼠隨機分為疏血通實驗組和生理鹽水對照組，每組12只。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉;將動物俯臥位固定，脫毛、碘伏消毒、鋪巾，采用改良McFarlane皮瓣制作方法［1］，以大鼠背部兩髂嵴連線為蒂，在背部正中設計一長9 cm、寬3 cm矩形隨意型皮瓣，沿設計線切開皮膚、皮下組織達深筋膜淺層，保留真皮下毛細血管網，于深筋膜淺層表面分離皮下組織，遇到軸型血管即以4-0絲線結扎。皮瓣完全掀起后，徹底止血，立即用4-0縫線距皮緣0.5 mm、間距1 mm原位間斷縫合。切口周圍聚維酮碘消毒后涂抹金霉素軟膏，兩組在手術后立即經腹腔注射藥物。實驗組腹腔內注射疏血通注射液1.5 mL·kg－1· d－1，對照組腹腔內注射滅菌生理鹽水 1.5 mL·kg－1· d－1，均單籠飼養。為減少手術操作帶來的誤差，所有手術由同一人完成。

1.3 標本處理

注射后第7天將大鼠處死，將皮瓣3等分(見圖1)，分別在皮瓣近蒂部(Ⅰ區)、中部(Ⅱ區)和遠端(Ⅲ區)切取組織標本［2］。用10%甲醛溶液固定，常規脫水包埋切片行HE染色，光鏡觀察。

采用Elivison二步法進行免疫組化檢測VEGF表達。石蠟切片置于60℃烘箱中，烘片60 min。在微波爐里加熱0.01 mol枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)至沸騰后將組織防脫片放入，中高火加熱7 min;取出微波盒流水自然冷卻。從緩沖液中取出玻片，蒸餾水沖洗，PBS沖洗，每張切片加1滴3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，滴加一抗50 μL，4℃過夜。37℃復溫45 min，PBS 沖洗，滴加二抗 50 μL，37 ℃ 孵育 1 h，PBS沖洗，DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，PBS沖洗，蘇木精復染1 min，蒸餾水浸泡，脫水和透明，封片和鏡檢。

圖1 大鼠背部隨意型皮瓣設計及分區示意圖

1.4 皮瓣存活面積比的檢測

術后1～7 d，每天肉眼觀察皮瓣存活狀況(顏色、質地、壞死面積等)并記錄。術后第7天，各組大鼠在麻醉狀態下用透明紙覆蓋，準確測量皮瓣成活或壞死面積，并剪成成活或壞死兩部分，分別以電子秤測質量。按以下公式計算皮瓣存活面積比:皮瓣存活面積比=皮瓣存活面積玻璃紙質量÷皮瓣總表面積玻璃紙質量×100%。皮瓣壞死標準:皮瓣顏色發黑，組織回縮、彈性差，質地堅硬，切割組織不出血;病理表現為組織崩解、細胞核消失、炎癥細胞廣泛浸潤、有局灶出血。

1.5 皮瓣組織學檢測

于皮瓣術后第7天取皮瓣標本，OCT包埋劑包埋，液氮中保存，冰凍切片厚度為5 mm，進行HE染色。100倍光鏡下觀察肉芽組織層厚度、組織水腫、壞死、炎癥細胞浸潤等情況，并進行微血管密度檢測。計數方法為:每組1張切片，每張切片在中央區和周邊區隨機選取5個高倍(放大200倍)視野，血管計數后取其平均數。每高倍鏡野為0.305 mm2，計算出單位面積微血管數目(個/mm2)作為評價微血管密度的指標。

1.6 VEGF 檢測

在光學顯微鏡下觀察經免疫組織化學Elivison二步法檢測VEGF的組織切片，先用低倍鏡尋找陽性表達密集區域，然后改用高倍鏡觀察。每張片子選取5個高倍(放大400倍)視野，用配套的圖像采集系統拍攝保存。拍攝過程中，白平衡、光圈、快門時間等參數設定保持一致。將保存的圖片導入Image-Pro Plus v 6.0軟件，選擇需要分析的指標“累積吸光度IA值”，讀取IA數值進行測量，作為評價VEGF表達的指標。

1.7 統計學處理

數據均采用均數±標準差表示。用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析。GraphPad.Prism 5.0制圖，檢測結果分析采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組皮瓣大體形態學比較

術后第1天，兩組皮瓣均出現不同程度的腫脹，Ⅲ區呈暗紫色，但無明顯壞死;術后第3天，實驗組、對照組皮瓣Ⅱ區和Ⅲ區出現局灶狀、小片狀壞死，壞死部分多呈紅褐色，有淤血;術后第7天兩組皮瓣Ⅱ區和Ⅲ區壞死部分均趨于融合，有黑色痂殼出現，手感變硬，皮瓣分界基本穩定(見圖2)。

圖2 兩組大鼠隨意型皮瓣術后大體形態觀察

2.2 兩組皮瓣存活面積比比較

實驗組皮瓣的存活面積比為(72.52±2.23)%，對照組皮瓣存活面積比為(50.36±2.37)%，兩組皮瓣的存活面積比差異有統計學意義(t=3.506×10－5，P ＜0.01)。

2.3 兩組皮瓣組織學檢測

兩組皮瓣術后第7天的Ⅲ區組織學形態相似，均表現為急性炎癥細胞浸潤，90%肉膜層表現為肌纖維變性壞死。實驗組Ⅰ區存活情況與對照組相比，組織水腫、血管擴張、炎癥細胞浸潤較輕(見圖3)。實驗組新生血管計數Ⅰ區(34.71 ±6.37)個/mm2，Ⅱ區(27.42±4.21)個/mm2;對照組新生血管計數Ⅰ區(32.71 ±5.36)個/mm2，Ⅱ區(17.45 ±5.43)個/mm2;兩組Ⅲ區皮瓣均壞死。兩組皮瓣Ⅰ區微血管密度差別無統計學意義(t=0.269，P ＞0.05)，Ⅱ區微血管密度實驗組大于對照組(t=3.800 ×10－3，P ＜0.05)。

圖3 兩組Ⅱ區皮瓣組織學觀察(HE染色)

2.4 兩組皮瓣VEGF檢測結果比較

兩組免疫組織化學染色結果見圖4。VEGF的IA值實驗組為4731.24 ±448.99，對照組為2466.01 ±801.67，差異有統計學意義(t=4.320 ×10－3，P ＜0.01)。

圖4 兩組血管內皮生長因子表達(免疫組織化學 ×400)

3 討論

隨意型皮瓣是臨床上修復創面、重建功能、改善外形常用的皮瓣，但在臨床超過一定長寬比其遠端易發生缺血壞死，這可能與血供不足、缺血再灌注損傷以及細胞凋亡相關因子的參與等有直接關系［3-4］。

疏血通注射液是一種行氣活血中成藥，其主要成分是水蛭和地龍［5-6］。其中水蛭最主要的提取物是水蛭素。水蛭素是目前發現作用最強的凝血酶特異性抑制劑，具有很強的抗凝作用。它通過與凝血酶直接結合而發揮抗凝作用，同時抑制凝血酶誘導的血小板激活，具有明顯的抑制血小板聚集作用;另外水蛭素有直接溶解血栓和抗血栓形成作用，它不僅可以與血漿中游離的凝血酶結合，還可中和與纖維蛋白結合的凝血酶，用于治療各種原因引起的血栓［7］。研究表明，局部運用水蛭素對皮瓣靜脈淤血有明顯的防治作用［8-9］。疏血通注射液的另外一種成分是地龍，其提取物中含有蚓激酶，也是一種高效抗凝、促纖溶作用物質。在體外具有很強的纖溶活性，在體內、體外能夠促進組織纖溶酶原激活物的表達，具有促進血栓溶解、恢復血流灌注，并防止血栓再次形成的作用，對于改善血液循環有一定的意義［10］。

缺血組織中組織因子的水平增高［3］，組織因子與Ⅶ因子結合是血液凝固的一條主要途徑，阻止兩者的結合可以抑制血栓形成，增加皮瓣血供，從而提高皮瓣存活率。全身應用疏血通注射液能有效降低缺血皮瓣的壞死，并有利于早期皮瓣的存活，可能與上述物質相互作用，防止血栓形成，改善局部皮瓣血液循環有關。在本文資料中，實驗組皮瓣存活面積明顯大于對照組證實了疏血通注射液在改善局部皮瓣血液循環中的作用。

中醫學認為“氣血相關”，“行氣通脈”，“補氣活血”，“脈者血之府也”，因此具有行氣活血作用的中藥可能具有促血管生成作用，這為中藥促血管生成奠定了理論基礎。本實驗結果證實，在皮瓣壞死與存活并存的Ⅱ區，實驗組出現大量的新生血管，血管密度增大。有研究表明:VEGF直接作用于血管內皮細胞促其增殖分化，促進皮瓣的毛細血管新生，提高再生血管的數量和質量，加快皮瓣與受區及皮瓣與切緣之間的血運重建，改善皮瓣遠端微循環，從而促進皮瓣成活［11］。疏血通注射液可以促進糖尿病后肢缺血大鼠腓腸肌中VEGF表達增加［12］，以及缺血腦組織中VEGF的表達［13］，從而促進毛細血管生成，發揮保護作用。本研究也觀察到實驗組皮瓣VEGF表達較對照組增多，這提示疏血通注射液可能作用于缺血皮瓣，通過增加VEGF等血管生長因子的表達以增加皮瓣局部新生血管增生、提高血管密度，最終促進皮瓣的存活。

應用疏血通注射液能有效刺激新生血管增生，降低炎癥反應，減少缺血皮瓣的壞死，并有利于提高超長隨意型皮瓣的成活，有望解決皮瓣遠端易壞死的臨床問題，但具體的作用機制還需進一步探討。

1 Khouri RK，Brown DM，Leal-Khouri SM，et al.The effect of basic fibroblast growth factor on the neovascularisation process:skin flap survival and staged flap transfers［J］.Br J Plast Surg，1991，44(8):585-588.

2 Schlaudraff KU，Bezzola T，Montandon D，et al.Mixed arterio-venous insufficiency in random skin flaps in the rat:is the application of medicinal leeches beneficial［J］.J Surg Res，2008，150(1):85-91.

3 張福慶，閔定宏.缺血性皮瓣的研究現狀與進展［J］.江西醫學院學報，2006，46(4):214-216.

4 金國軍，張松林.細胞凋亡相關因子在外科皮瓣成活中的作用［J］.華北煤炭醫學院學報，2006，8(3):313-315.

5 Jin X，Shen G，Gao F，et al.Traditional Chinese drug ShuXueTong facilitates angiogenesis during wound healing following traumatic brain injury［J］.J Ethnopharmacol，2008，117(3):473-477.

6 牛惠英.依達拉奉聯合疏血通注射液治療急性腦梗死臨床研究［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2010，8(11):1325-1326.

7 Salzet M，Chopin V，Baert J，et al.Theromin，a novel leech thrombin inhibitor［J］.J Biol Chem，2000，275(40):30774-30780.

8 陳偉華，玉光哲，尚勇，等.局部應用水蛭素對擴張皮瓣靜脈淤血的防治［J］.中國實用美容整形外科雜志，2005，16(5):313-315.

9 孫智勇，王剛，楊曉楠，等.天然水蛭素對豬隨意型皮瓣靜脈淤血影響的實驗研究［J］.中國修復重建外科雜志，2008，22(11):1296-1300.

10 白鳳瑞，呂志陽.藥用地龍的研究進展［J］.黑龍江醫藥，2010，23(4):610-613.

11 Zhang F，Lineaweaver W.Acute and sustained effects of vascular endothelial growth factor on survival of flaps and skin grafts［J］.Ann Plast Surg，2011，66(5):581-582.

12 魏靜，陳兵，田志強，等.疏血通注射液對糖尿病下肢缺血大鼠VEGF表達的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2009，7(9):1048-1049.

13 張璇.疏血通注射液對局灶腦缺血大鼠VEGF表達的影響［J］.中國神經免疫學和神經病學雜志，2005，12(4):246.