HLA抗原系統與移植臨床

周永昌

器官移植是治療終末期器官功能衰竭最有效的方法，目前隨著手術方式的改進和新型免疫抑制劑的臨床應用，移植器官早期存活率明顯提高，但長期存活率仍不理想。臨床實踐表明，器官移植的成敗取決于供受者間的組織相容性，其中HLA等位基因匹配程度起關鍵作用，是影響移植器官長期預后的重要因素。本文就HLA抗原系統的基本知識及與移植臨床的關系作一簡要介紹。

1 HLA抗原系統的由來與發展歷程

HLA是迄今為止最復雜的人類基因系統。1952年Jean Dausset首次報道了HLA-A2抗原，并因此獲得1980年的諾貝爾獎［1］。至20世紀70年代共發現21個HLA等位基因。隨著分子生物學檢測技術的不斷改進，越來越多的等位基因被發現，迄今發現的HLA等位基因已近5000個。

1964 年，Terasaki［2］發明了 HLA 微量檢測方法，患者淋巴細胞上相應的抗原會與抗體發生反應，在補體的作用下淋巴細胞死亡。此時通過染色顯示出結果，即可用已知的抗體檢測未知的抗原。該方法被美國國立衛生院定為國際標準，即補體依賴的細胞毒(complement dependent cytotoxicity，CDC)方法。從20世紀90年代以前以血清學方法為主到單克隆抗體技術(One Lambda公司)，再到90年代中期發展起來的分子生物學技術，HLA抗原檢測方法主要經歷了血清學、CDC、ELISA和Luminex?磁珠分析等的不斷改進，研究人員和系統結構也發生相應的變化，研究理論也從細胞、體液水平到抗原決定簇、分子結構快速發展。技術方法的不斷改進和研究理論的不斷發展，使HLA配型成功應用于器官移植臨床。20世紀60年代中期以后，器官移植數量顯著增加。目前，全球每年都會進行200萬次左右的HLA配型，絕大部分采用的是分子生物學方法。

1967年，HLA的基因位點被證實在第六號染色體短臂上。當時只發現了HLA-A和B兩個位點，發現的HLA只有21個。到第8屆國際HLA研討會時，總共發現79個HLA。由于在20世紀90年代大部分的HLA配型仍由單克隆抗體板檢測，至90年代末已知的HLAⅠ類抗原不到100個。根據the international ImMunoGene Tics information system?數據庫(版本:3.0.0)的統計顯示，截至2010年4月HLA等位基因總數為4633個，其中Ⅰ類為3411個(包括A位點1001個、B位點1605個和C位點690個)，Ⅱ類1222個(包括DRB1位點878個)，以及其他與HLA相關基因110個(包括MICA 69個、MICB 30個、TAP1 7個和TAP2 4個)。臨床常檢測的是A、B、DR 3個位點。隨著檢測技術的改進，發現了越來越多的HLA等位基因，特別是近10年，再過幾年HLA等位基因數將超過1萬。

2 HLA抗原系統的管理及命名原則

新發現的等位基因需要命名，其生物學功能和意義需要驗證，這需要國際間良好的交流與合作。這方面的工作應有相應的機構進行管理和協調。美國組織相容與免疫遺傳學會(American Society for Histocompatibility and Immunogenetics，ASHI)是公認的HLA領域的權威機構，另外還有WHO HLA命名委員會、Anthony Nolan研究所、美國國家骨髓庫和器官分配聯合網絡，以及歐盟免疫及組織相容學會等，這些機構如同一個大機構下的不同分支，通過分工合作共同管理HLA系統。

按照WHO的規定，描述HLA某個抗原或等位基因的格式為:大寫的HLA(說明是HLA的檢測)，HLA后面一個橫杠，橫杠后的大寫字母A代表A位點，B代表B位點，以此類推;位點后面如果加*號，提示為分子生物學檢測結果，*后至少為4位數字，如HLA-A*0101;如果不加*號，提示為血清學檢測結果，位點后只需要兩位數字，如HLA-B13。常規的分子生物學檢查結果用4位數字表示，如HLA-A*0201，前兩個數字代表基因家族，后兩個數字代表該家族不同的成員，如 HLA-A*0201和HLA-A*0202。從2010年4月1日開始，WHO的HLA命名規則發生改變，即HLA抗原家族和成員之間用冒號分隔，如HLA-A*02:04。

3 HLA的分子結構及免疫活性

HLAⅠ類抗原的分子結構由兩條多肽鏈組成，即具有多態性的α鏈(重鏈)和非多態性的β鏈(輕鏈)。這兩條多肽鏈盤曲折疊后構成4個結構區域(α1、α2、α3 和 β2)，分子頂部的 α1 和 α2 兩個區域間由2個α螺旋和8個β折疊組成多肽結合槽(peptide binding groove)，這個區域是抗原識別部位，即決定HLA抗原特異性的部位。α鏈的羧基端(α3的尾端)穿過細胞膜插入細胞質，以此將HLA分子固定在膜上，并傳遞細胞內外的信號。β鏈不具備多態性。許多等位基因名稱不同的原因是在抗原識別部位以外存在不同的氨基酸序列，而這些等位基因在抗原識別部位的氨基酸序列是完全一樣的。目前尚未發現抗原識別部位以外的差異具有免疫學意義，因此，雖然等位基因不同，但如果抗原識別部位的氨基酸序列完全相同，則可被視為HLA高分辨率相合。

HLAⅠ類抗原識別部位在第2和第3外顯子，HLAⅡ類抗原識別部位在第2外顯子。例如:“B*07:05，B*15:02”與“B*07:06，B*15:02”，其中B*07:05與B*07:06的區別只在第5外顯子281密碼子的第1個核苷上，而在第2和第3外顯子的氨基酸序列完全相同，兩者一般不存在功能上的差異。這也是為什么ASHI將氨基酸序列在第2和第3外顯子完全相同(Ⅰ類)和在第2外顯子完全相同(Ⅱ類)的等位基因視為可接受的高分辨率結果的原因。如果不了解ASHI可接受的高分辨率定義，很多難得的供者將被視為不理想供者而被排除。

表1為1份HLA配型高分變率檢測報告。盡管例2～例6供者與受者的等位基因不完全相同，但這些不同均在抗原識別部位以外。根據ASHI標準，這些供者與受者HLA高分辨率相合，即為零錯配。

4 供者特異性抗體及其臨床意義

移植后，如果受者血清中發現有針對供者的抗體，該抗體稱為供者特異性抗體(donor specific antigen，DSA)。例如，供者抗原為 HLA-A11、HLAA24，移植后患者出現抗 HLA-A11和抗 HLA-A68抗體。此時，抗HLA-A11抗體為DSA，抗A68抗體為非DSA。當受者出現DSA時，移植物發生排斥反應的概率明顯增加。有報道，移植失敗的患者中有24%存在DSA，而對照組只有1%存在DSA［3］。

因此，建議在行HLA不相合親緣骨髓移植前將患者血清與供者淋巴細胞進行細胞毒交叉反應試驗來篩查HLA抗體，細胞毒交叉反應試驗陽性者進一步檢測DSA［4］。骨髓移植受者細胞毒交叉反應試驗陽性者，排斥反應發生率高達62%。

過去，臨床醫生很難理解為什么患者會產生針對自身抗原的抗體。例如，患者的抗原是HLADR4，血清里檢測出的抗體也是針對HLA-DR4。長期以來的認識是實驗室檢測存在質量問題，隨著檢測技術分辨率的提高，證實患者的抗原是HLA-DR*04:05，而血清抗體是抗HLA-DR*04:01。

表1 HLA配型高分辨率檢測報告

檢測抗HLA抗體對及時發現移植器官排斥反應至關重要。檢測頻率各中心不同:如果手術前受者抗HLA抗體陰性，可考慮術后每3個月檢測1次，然后每年檢測1次。如果手術前受者抗HLA抗體陽性，則需要術后嚴密觀察，增加抗HLA抗體檢測的頻度。

當某個HLA抗原與一個抗體發生反應時，另外的抗原也會與這個抗體發生反應。后來證實，這些抗原在分子結構上存在共性，該分子結構稱為抗原決定簇。HLA抗原與抗體并非一把鑰匙一把鎖，常為一個抗體與多個抗原反應;同一組抗原在分子結構上存在共性。抗原決定簇的發現具有實際臨床意義，但其檢測的實驗室技術要求較高。目前發現的抗原決定簇有HLAⅠ類110個(A位點34個、B位點44個、C位點4個、A-B位點20個、B-C位點5個和A-B-C位點3個);HLAⅡ類83個(DR位點60個、DQ位點18個、DP位點5個);MICA 7個。

根據抗原決定簇理論，A2與A68為一個抗原決定簇。A2與B57、B58為另外一個抗原決定簇。某患者移植后前6年沒有檢測出抗HLA抗體，血清肌酐水平也維持正常。6年后檢測出抗HLA抗體，其中包括抗供者的HLA-A2抗體，同時檢出的還有抗HLA-A68、B57和B58抗體。抗體出現后，患者血清肌酐水平明顯升高，并發生了移植物排斥反應。

5 抗HLA抗體檢測技術

以前缺乏抗HLA抗體導致器官移植排斥反應的證據主要是因為沒有精確的實驗室檢測技術和方法。

Terasaki在20世紀60年代創建了加州大學洛杉磯分校的免疫遺傳實驗室，這是目前HLA領域全球最大的實驗室，該實驗室在2009年共完成100 000例HLA檢測。20世紀70年代，Terasaki教授在美國洛杉磯大學加州分校建立了國際細胞交換中心，與美國國內207個實驗室和國外91個實驗室進行數據共享。該中心每個月將已知結果的標本(包括血清標本、DNA標本和細胞標本)發送到這些實驗室供其檢測，用以統計對某個HLA抗原或抗體的檢測精確度。由于HLA抗原的特性不同，有的抗原容易被檢測出來，有的則很難。HLA抗原數字越小的抗體相對容易檢測出來，數字越大越難檢測。所以，評估一個實驗室的質量，不僅看其錯誤率，而且要看錯在哪個抗原或抗體上。

目前比較常見的檢測抗HLA抗體的技術有傳統的CDC、ELISA、流式細胞分析和最新的Luminex?磁珠分析。幾種方法比較來看，CDC敏感性不高，許多CDC陰性結果者經流式細胞分析檢測為陽性結果。ELISA的敏感性高于CDC，但仍不如流式細胞分析方法。而傳統的流式細胞分析與Luminex?磁珠分析技術相關性很好。

最新的Luminex?磁珠分析的原理是在微磁珠上包備純化的HLA抗原。如果血清中存在抗體，抗原抗體結合后，該磁珠發出熒光。流式細胞儀的激光可將其反應強度進行數字化處理，從而獲得精確的抗體特異性和強度。磁珠上可包備細胞即某個供者的細胞，上面包含了幾個抗原。也可包備純化的單一抗原。如果單純檢測群體反應性抗體(抗HLA抗體)的效價，可采用前者。如果具體檢測某個抗體，可采用單一抗原磁珠。只要這個磁珠呈陽性反應，即可獲得準確結果。流式細胞儀內有兩個激光。紅色激光負責識別磁珠的身份，即第幾號磁珠;綠色激光負責識別磁珠上的生物反應。兩個激光共同判定以獲得結果。

單一抗原磁珠技術可幫助高群體反應性抗體患者獲得器官。由于有了精確的檢測技術，臨床很多高群體反應性抗體患者仍可以接受移植。如某受者其抗原為 A2，A3，B18，血清中檢測出抗 HLA-A1、A11、A23、A24、A29、A30、A66、A68、B8、B13、B38、B44、B45和 B53抗體。如果供者器官的抗原是A31、A33、B46和B51，則受者不存在相關抗體，移植后發生排斥反應的概率會很低。

1 Richmond C.Jean Dausset［J］.Lancet，2009，374(9698):1324.

2 Terasaki PI，Mcclelland JD.Microdroplet assay of human serum cytotoxins［J］.Nature，1964，(204):998-1000.

3 Spellman S，Bray R，Rosen-Bronson S，et al.The detection of donor-directed，HLA-specific alloantibodies in recipients of unrelated hematopoietic cell transplantation is predictive of graft failure［J］.Blood，2010，115(13):2704-2708.

4 Blume KG，Forman SJ，Applebaum JR，et al.Hematopoietic cell transplantation from HLA partially matched related donors［M］//Blume KG，Forman SJ，Applebaum JR.Thomas'Hematopoietic Cell Transplantation. 3rd ed. Boston:BlackwellScience， 2004:1116-1131.