藥用植物黃酮類化合物的提取方法

吳聰華，程 華，李琳玲，姜德志，袁紅慧，程水源*

(1.經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，湖北 黃岡 438000；2.黃岡師范學院化學與生命科學學院，湖北 黃岡 438000；3.武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430074)

0 引 言

黃酮類化合物(flavonoids)是一類存在于自然界的、具有2-苯基色原酮(flavone)結構的化合物.它們分子中有一個酮式羰基，第一位上的氧原子具堿性，能與強酸成鹽，其羥基衍生物多具黃色，故又稱黃堿素或黃酮[1].黃酮(flavonoids)主要是由C6-C3-C6組成(圖1).依據C3部分的形成方式(氧化、成環、取代)的差異，可將黃酮分為黃酮醇、查爾酮、橙酮、黃酮類、異黃酮、花青素以及各類二氫衍生物[2-3].

圖1 黃酮類化合物的基本骨架

對于人類來說黃酮類化合物不僅賦予了植物美好的顏色和口感，而且這些化合物本身對人類健康具有多種保健和醫藥功能[4].它們可以清除自由基，抗氧化，消炎，抗病毒，抗癌，發揮植物雌激素活性，保護心血管系統和肝臟，抑制酒精嗜好癥，防止骨質疏松等.隨著分離純化技術的發展，發現的黃酮類化合物種類越來越多.為了找到更多、藥效更好的黃酮單體并研究其藥理作用，對藥用植物中黃酮的分離提純方法[5]研究就顯得尤為重要.

1 藥用植物黃酮類化合物的提取工藝

1.1 植物黃酮類化合物簡介

黃酮類化合物是一種植物中分布廣而且重要的多酚類天然產物，廣泛存在于高等植物，也存在于許多低等植物如苔蘚和地錢中，即幾乎存在于所有的綠色植物中，尤以蕓香科、唇形科、石南科、玄參科、豆科、苦苣苔科、銀杏科和菊科等高等植物中分布較多[6].在中草藥和現代醫藥方面，黃酮類化合物有著重要的作用.銀杏、菊花、葛根、柚皮、馬鞭草、金銀花等一系列富含黃酮類化合物植物的研究不斷深入，科研工作者在黃酮的提取方面做了大量工作[7-13].

1.2 黃酮類化合物提取方法

1.2.1 水提取法 黃酮類化合物的水提取法(Water Extraction, WE)是一種較傳統的方法[14]，目前已較少使用.在不破壞黃酮化合物結構的情況下，林啟訓[15]對枇杷葉中黃酮類化合物進行了相關提取摸索，并且摸索出了一套優化提取條件.肖坤福[16]在對多穗柯中黃酮類物質提取工藝的研究中也對水提法作了較詳細的介紹，此法為日常生活中食用富含黃酮類化合物食物提供了較好的參考價值.

1.2.2 醇提取法 醇提取法(SE)較水提法效率要高.對于含黃酮植物，有機溶劑提取法是比較常用的一種方法.SE法提取有機溶劑主要有乙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙醚等，其中最常使用的溶劑是乙醇.劉銀芳[17]摸索出了一套優化的乙醇提取條件，給沙苑子中黃酮類化合物的提取帶來了極大的便利.陳少峰[18]在提取柴胡中總黃酮時，選定的優化條件為：溫度80 ℃、柴胡顆粒粒徑1 mm、乙醇體積分數60%、攪拌速度300 r·min-1，實驗發現表觀活化能為33.271 kJ·mol-1.在醇提法中，甲醇也是一種常用的提取劑，較之乙醇其提取效果更好.在實驗過程中，為了得到純度更佳的黃酮類化合物，通常還要進行石油醚或己烷的脫脂或脫色素預處理，然后再用甲醇、乙醇、丙醇及它們的一系列水溶液溶劑來進一步提取.

1.2.3 超聲波提取法 超聲波提取法(ultrasound-assisted extraction, UAE)是目前應用較為廣泛的一種方法，具有操作方便，實用性強等特點.卞杰松[19]在對馬鞭草中黃酮化合物的測定中，利用超聲波結合乙醇法得到的黃酮類化合物的總含量為8.36 mg/g，回收率為99.56%，效果良好.很多科研工作者將超聲波法和其它方法聯合在一起效果更佳.通過微波-超聲波法的協同作用，張培宇等[20]對馬齒莧中黃酮化合物的提取工藝進行了優化：在馬齒莧20倍量體積分數為70%乙醇的條件下，輔助微波功率600 W處理5 min，置80 ℃溫水浴中超聲提取2次，每次提取15 min；此時的提取產率為11.35%，而相同條件下超聲波法和微波法的提取產率分別為5.79%和4.56%.由此可見，微波-超聲波聯用比單獨提取效果更好.此外，在醇提法的基礎上還可以使用超聲波法做預處理，效果也較理想.例如，張公亮[11]采用超聲波萃取法，研究仙人掌黃酮類化合物的提取工藝.通過試驗確定了超聲波功率、乙醇體積分數及輻射時間的最佳參數，實驗結果表明提取最佳條件為：乙醇體積分數65%、功率550 W、輻射時間12 s，并且AB-8型樹脂分離提純效果最好，吸附率為84.81%，解吸率達88.42%.

1.2.4 微波提取法 微波提取法(Microwave extraction, ME)同其它方法相比具有操作簡便，耗能耗材少等優點.尤其對特定的藥材提取效果更為理想.譚靜[21]等通過微波提取法和超聲波提取法提取柚皮中的黃酮類化合物進行了對比，實驗發現：微波萃取法提取柚皮中黃酮類化合物的最佳條件為料液比1∶25(質量分數)、提取時間為20 min、提取溫度為50 ℃、乙醇體積分數為60%時，黃酮得率最高，為8.437 mg/g；超聲波提取法提取柚皮黃酮的最佳條件為：料液比1∶25(質量分數)、提取時間為10 min、提取溫度50 ℃、乙醇體積分數50%，此時黃酮得率為5.263 mg/g.微波法常用來作為一種輔助手段使植物黃酮提取效率最大化.

1.2.5 超臨界萃取技術 超臨界萃取技術(supercritical fluid extraction, SFE)是使用較為廣泛的藥物提取、分離手段，在藥物成分提取方面有著重要的應用意義.王敏[22]通過試驗對銀杏葉黃酮的超臨界萃取技術進行了優化，并且實現了萃取和分離一體化，其最佳參數為：CO2流速為20 L/h，乙醇體積分數為80%，乙醇夾帶劑用量為100 mL/100 g銀杏葉，萃取時間為2 h，萃取溫度為45 ℃，萃取壓力為30 MPa.在對鎖陽黃酮化合物超臨界二氧化碳的提取研究中，Luan N[23]通過實驗找到了最佳提取參數：在粒度為0.180～0.250 mm篩，壓力為30 MPa，溫度為50 ℃，時間為75 min，酒精體積分數為50%，攜帶率為8%，通量二氧化碳為5 mL/min條件下，總黃酮的產率可達21.18%.

1.2.6 酶解法 酶解法(enzyme-assisted extraction, EAE)是通過酶的作用裂解植物細胞壁，使得植物次生代謝產物充分得到釋放，從而提高藥用成分得率一種分離提取方法.吳梅林[9]在研究銀杏黃酮類化合物酶解法的提取條件中獲得了黃酮類化合提取的最好條件，與傳統的乙醇提取工藝相比，銀杏總黃酮得率提高了18.92%.龐允[7]在研究銀杏葉中黃酮的提取工藝時發現，酶解法同乙醇提取法相比，黃酮的提取率由1.29%提高為1.78%.劉曉光[24]采用酶解法對山楂中黃酮的提取工藝進行了研究，在酶質量濃度為0.15 mg/mL，酶解pH值為5.0，酶解溫度55 ℃，酶解時間為90 min，料液比為1∶12 (質量比)時，提取效果最佳.該方法提取黃酮的得率可達90%，而且黃酮的生物活性保持良好.在酶解法中，酶種類的選擇對提取效率也有一定的影響.林宣賢[25]分別用單一酶和復合酶方法對金櫻子黃酮進行提取，結果發現，復合酶(纖維素酶+果膠酶+β-葡聚糖酶+半纖維素酶+木瓜蛋白酶)處理效果比單一酶要好，最后提取總黃酮產率真提高了26.2%.

2 黃酮類化合物主要分析方法

2.1 紫外分光光度法

紫外分光光度法(UV spectrophotometry)測定原理是：黃酮類化合物固有的結構可以與Al3+結合形成絡合物，并且在不同條件下具有不同的紫外吸收峰，因此可以對不同的黃酮類化合物進行分析測定.張公亮[26]和齊曼麗[27]在研究中發現，黃酮類化合物直接與AlCl3絡合時，在415 nm可以檢測到總黃酮最高吸光值.而與Al(NO3)3作用時，在271 nm處可以檢測到黃酮類化合物的最高吸收值，從而可以對其進行定量測定[28].呂紅[29]在267 nm條件下直接測定銀杏制劑中的黃酮含量，效果也較好.研究[30]發現，并不是所有的黃酮類化合物都能與鋁鹽發生絡合.杜薇[31]在有醋酸鉀或醋酸鈉存在的條件下測定刺梨總黃酮含量，AlCl3與黃酮類化合物共存40 min后，可在420 nm處測定總黃酮的含量.張進棠[32]采用此法測定銀杏中黃酮總含量時相對標準偏差為2.1%.同時，張蘭杰[33]利用雙波長法測得黑玉米花粉中總黃酮平均含量為3.53%.此法穩定可靠，重現性好.另外，肖福坤通過三波長分光光度法測定芹菜中總黃酮的質量分數質量分數為[34]，回收率為96.8%～105.9%，變異系數小于0.49%，方法的準確度與精密度均令人滿意，而且操作簡便易行.

圖2 AlCl3和AlCl3/HCl對黃酮紫外光譜的影響

2.2 傳統色譜柱純化

傳統色譜柱純化(Column purification)在分離純化黃酮類化合物方面有著重要的作用.程秀麗[35]在研究羅布麻葉中黃酮類化合物時，采用聚酰胺柱、硅膠柱和Sephadex LH-20柱層析法對黃酮進行純化，通過化學、波譜方法分離得到了8種黃酮類物質，并且鑒定出其中的5種化合物.徐小花[36]采用硅膠柱層析、Sephadex LH-20、重結晶等方法，在女貞子(Ligustrum lucidum Ait)果實中分離得到了芹菜素(Ⅰ)、大波斯菊苷(Ⅱ)、芹菜素-7-O-乙酰-β-D-葡萄糖苷(Ⅲ)、芹菜素-7-O-β-D-蘆丁糖苷(Ⅳ)、木樨草素(Ⅴ)、木樨草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅵ)、槲皮素(Ⅶ)等7種黃酮類化合物.在對連錢草黃酮化合物成分的研究中，楊念云[37]采用工業酒精提取、硅膠柱層析、ODS柱層析和重結晶相結合的方法，首次從連錢草中分離得到了芹菜素(1)、木犀草素(2)、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸乙酯苷(3)、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸乙酯苷(4)、大波斯菊苷(5)、木犀草素-7-O-葡萄糖苷(6)、山奈酚-3-O-蕓香糖苷(7)、蘆丁(8)、6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖-芹菜素(9)和6-C-葡萄糖-8-C-葡萄糖-芹菜素(10)等10種黃酮類化合物.

2.3 薄層色譜法

薄層色譜法(Thin layer chromatography, TLC).梁淑芳[38]在研究山楂時，采用十二烷基硫酸鈉-正丁醇-正庚烷-水微乳液作為展開劑，利用聚酰胺薄層色譜法將山楂黃酮完全分離，總共獲得了7個黃酮斑點.衛靜莉[39]采用薄層色譜法對樹脂純化后的無梗五加果總黃酮進行了研究，發現薄層層析鑒定效果較好.鄭大成[13]利用薄層色譜法和化學定性分析法對昆侖雪菊水溶性黃酮進行初步的色譜和化學鑒定，結果顯示水提物經正丁醇萃取后，大部分黃酮類成分被轉移至正丁醇層，該方法成功應用于昆侖雪菊水溶性總黃酮的制備.

2.4 高效液相色譜法

高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)最早由俄國植物化學家茨維特(Tswett)1906年提出，后經過不斷改進和創新現已得到廣泛應用.在測定鳳尾茶中黃酮的含量時陳海云[40]運用島津LC-2010A，色譜柱為Agilent-Extend-RP柱，流動相甲醇-乙腈-0.2%(質量分數)磷酸，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長280 nm，在0.244～2.928 μg線性關系良好，回收效率較高.而賀云彪[41]在采用高效液相色譜法測定黃芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量時，借直觀推導式演進特征投影(HELP)法分辨HPLC-DAD產生的二維數據得到毛蕊異黃酮的標準曲線為y=166.72x+127.8(r=0.999 7)線性范圍為1.0～116.5 μg/mL；孟雙明[42]運用高效液相色譜法對黃酮含量進行分離測定，得到了蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素的RSD分別為1.7%，2.0%，3.1%和3.9%.張宏武[43]采用Sunfire C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 mm)，以乙腈-0.1%(質量分數)磷酸溶液(體積比20∶80)為流動相，流速為1 mL·min-1，檢測波長為283 nm，柱溫為30 ℃時，測定枳殼飲片中柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷四種黃酮類化合物的平均回收率分別為96.6%，96.1%，96.0%和97.2%，此法快速、準確、重復性好.

2.5 其它分析方法

除了以上分離純化方法外，還有其他一些方法應用較為廣泛.張軍[44]采用高效毛細管電泳法對不同桑品種的桑葉中，進行了黃酮類化合物的圖譜建立，在25 ℃、20 kV的壓力下進行電泳，245 nm波長處檢測，線性關系良好.彭愛一[8]和余波[45]采用改進的高速逆流色譜法分離純化幾種黃酮類化合物，其純化率分別達到了95%和97%以上.多種分離純化技術的聯用也使得分離測定效果更佳，謝建偉[10]運用色譜和光譜聯用技術建立了4個產地黃芪中黃酮類化合物特征色譜指紋圖譜，張語遲[12]采用高效液相色譜-電噴霧質譜(HPLC-ESI MS)聯用技術分析了酶解前后黃酮化合物的活性，效果較為理想.

3 結 語

黃酮類化合物作為一大類植物次生代謝產物，不僅數量種類繁多，而且結構類型復雜多樣，表現出多種多樣的藥理活性.科研工作者正在不斷的完善各種分離純化手段，為獲得更好更多的黃酮類化合物或黃酮單體進行努力，鮑海鷗[46]等人對廬山的野生藥用植物資源給出了分析和建議，張馨心[47]和鄭有飛[48]就對黃酮的研究現狀進行了分析.對黃酮類化合物分離檢測純化方法的深入研究將對黃酮類化合物的開發應用，藥理活性研究等產生深遠的影響.

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