糖尿病增殖型視網(wǎng)膜病變外顯子組測序研究

楊光燃 阿 叁 馮 偉 馬 靖 朱曉蓉 安艷華 路晶凱 張秀清 楊金奎*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100730;2.深圳華大基因研究院，深圳 518083)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最為常見和嚴重的合并癥之一。在大多數(shù)國家，DR尤其是增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)，不僅是長病程糖尿病患者最常見、最主要的致盲原因，還是當今全世界20～65歲勞動群體的主要致盲原因。全球每年約有300～400萬人因DR而失明，其致盲率是非糖尿病患者的10～25倍［1］。除高血糖以及環(huán)境因素外，遺傳因素在DR的發(fā)生中同樣起著重要的作用。DR是一個多基因作用的疾病，每個基因都存在多態(tài)性現(xiàn)象。

全基因組外顯子測序是在全基因組范圍內(nèi)，對所有基因編碼蛋白質(zhì)區(qū)域的每一個堿基進行突變檢測。本研究擬利用目標區(qū)域捕獲技術與高通量測序技術對PDR患者的基因外顯子組進行測序，研究PDR與基因多態(tài)性的關系，尋找與PDR發(fā)病相關的基因及單核苷酸多態(tài)性。本研究組以2型糖尿病患者為研究對象，考慮到DR常發(fā)生在糖尿病病史前10年，因而選擇糖尿病病史至少10年但無視網(wǎng)膜病變(nondiabetic retinopathy，NDR)的患者作為對照組;選擇PD患者作為病例組進行病例對照研究。

1 對象和方法

1.1 對象

選擇于2009年1月至2010年10月在首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院就診的2型糖尿病患者中進行彩色眼底照相及眼科醫(yī)師檢眼鏡檢查者。根據(jù)2002年制定的國際糖尿病視網(wǎng)膜病變分級標準進行分期［2］，共入選無DR且糖尿病病史10年以上者240例，PDR患者320例。進一步選擇年齡45～75歲，糖尿病病史10年以上，空腹血糖＞6.5 mmol/L且糖化血紅蛋白≥7.0%，尿白蛋白排泄率＜300 μg/min且血肌酐＜445 μmol/L的北方漢族無DR患者50例作為對照組，男、女各25例。選擇年齡45～75歲，糖尿病病史＜15年，11.0% ＞糖化血紅蛋白≥7.0%，血肌酐＜445 μmol/L北方漢族PDR患者50例作為病例組，男、女各25例。各入選患者之間無血緣關系。排除標準:1)其他內(nèi)分泌疾患;2)酮癥酸中毒、高滲昏迷等急性病;3)自身免疫性疾病;4)青光眼、白內(nèi)障、眼外傷等影響眼底分級的疾病;5)近期內(nèi)有手術、急性感染，心腦血管疾病急性發(fā)作及其他應激狀態(tài)者;6)惡性腫瘤;7)妊娠;8)少數(shù)民族;9)高度近視;10)1型糖尿病、繼發(fā)性糖尿病及慢性胰腺炎;糖尿病分型不明確;11)合并非糖尿病所致的眼底疾患;12)貧血。

1.2 臨床指標測定方法

①測量血壓、體質(zhì)量、身高、腰圍、臀圍，并計算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)和腰臀比。② 全部患者空腹取血:測定肝腎功能、血脂、空腹血糖、糖化血紅蛋白。糖化血紅蛋白采用高壓液相法(variantⅡHbA1c高壓液相色譜分析儀，美國伯樂公司)，正常參考范圍4.0% ～6.0%。③ 8 h尿微量白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate，UAER)測定:所有患者收集晚10∶00到次日早晨6∶00共8 h的尿液，以化學發(fā)光法(Immulite 1000全自動化學發(fā)光免疫分析儀，美國德普公司)測定UAER。測定時排除泌尿系感染、發(fā)熱及劇烈運動等情況。所有患者均測定2次，取兩次測定結果的平均值。以UAER＞20 μg/min診斷為糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)。④ 眼底檢查:所有2型糖尿病患者均由眼科醫(yī)師進行散瞳后眼底檢查。同一患者散瞳后由本科室技術人員應用彩色眼底照相機(TRC-NW7SF，日本Topcon公司)行眼底照相檢查，拍攝雙眼眼底彩色照片。根據(jù)2002年制定的國際糖尿病視網(wǎng)膜病變分級標準進行分期［2］。2種方法診斷結果一致的患者入選本研究。按最重的眼的DR嚴重程度分級進行分組。

1.3 基因組DNA提取及外顯子組測序分析

取全血標本1 mL應用外周血DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA，紫外分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳進行DNA濃度及純度的測定。合格的DNA樣本送深圳華大基因研究院，應用NimbleGen商業(yè)化2.1M外顯子序列捕獲芯片進行外顯子組區(qū)域的測序。整個樣品制備過程包括雜交文庫制備、芯片雜交洗脫以及雜交后測序文庫制備，通過Illumina測序系統(tǒng)(Illumina HiSeq 2000測序系統(tǒng)，美國Illumina公司)獲得外顯子序列信息。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.5軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布的連續(xù)變量以均數(shù)±標準差(±s)表示;尿素氮、肌酐和UAER為非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示。2組間比較，正態(tài)分布的連續(xù)變量采用t檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用秩和檢驗進行分析。率的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05(雙側法)表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征

50例 NDR組中男性25例，女性25例，年齡(60.00±7.89)歲;50例PDR病例組中男性25例，女性25例，年齡(55.81±7.75)歲。2組患者的糖尿病病程分別為(13.67 ±3.87)年、(10.55 ±4.16)年，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0001，表1)。NDR組與PDR組BMI、腰臀比、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、糖化血紅蛋白、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、尿素氮、肌酐濃度2組間差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表1)。PDR組UAER濃度較NDR組高(分別為6.77 μg/min、64.15 μg/min，P=0.000，表1)。

表1 NDR和PDR組患者臨床特征比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics of patients between NDR and PDR group

PDR組較NDR組有較高的糖尿病腎病患病率，分別為 70.6%、21.6%(P=0.000)。NDR 和 PDR 組2組高血壓、冠心病、腦梗死的患病率分別為57.7%、60.4%;12.8%、13.0%;11.6%、6.4%，2 組間差異均無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。NDR組和PDR組間有糖尿病家族史者比例差異亦無統(tǒng)計學意義，分別為45.7%、43.8%(P＞0.05)。

2.2 外顯子組測序結果

外顯子組測序分析對目標區(qū)域平均測序深度為42×。測序原始序列平均長度為89 bp。最小等位基因頻率大于1%的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)為583 198個;進一步篩選測序深度大于4×且錯誤率小于0.1%的 SNPs共計165 560個，其中已報道非同義SNPs 14 386個，新的非同義SNPs 6 444個(表2)。

3 討論

在基因組水平，兩個人類個體之間僅有約0.1%的差異。這些差異可用于解釋個體在疾病易感性方面的不同。外顯子組只占人類基因組總量1%，包含了合成蛋白質(zhì)所需要的信息，涵蓋了與個體表型相關的大部分功能性變異，同時外顯子區(qū)域是目前基因組中被研究得最為成熟的一部分，使得研究人員能夠?qū)Πl(fā)現(xiàn)的變異所在的基因進行注釋和功能途徑分析。與全基因組重測序相比，外顯子組測序在保證有效獲取絕大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)的基因信息的同時大大降低了測序的總數(shù)據(jù)量，從而顯著降低了測序費用，因而成為目前的研究熱點。目前尚無關于PDR患者外顯子組測序研究。

表2 100例糖尿病患者外顯子組測序單核苷酸多態(tài)性結果Tab.2 Numbers of single nucleotide polymorphisms by exome sequencing in 100 diabetic patients

本課題組應用目標區(qū)域捕獲技術與高通量測序技術對PDR患者進行DNA外顯子組測序，選擇糖尿病病史10年以上且糖化血紅蛋白大于7.0%的NDR患者作為對照，發(fā)現(xiàn)多個可能與PDR易感性相關的SNPs。這些SNPs的改變尤其是非同義突變，可能通過引起編碼的氨基酸結構改變，使相應蛋白質(zhì)的功能、活性發(fā)生改變，從而參與PDR的發(fā)生和發(fā)展。以往關于DR基因多態(tài)性研究主要是有限制性片段長度多態(tài)性［3］、可變數(shù)的串連重復序列［4］、單核苷酸多態(tài)性等［5-6］。基因分型芯片僅對常見多態(tài)性位點進行測定，而與重測序研究相比，在基于芯片的基因分型研究中低頻突變的因素往往被忽略了;無法研究低頻率多態(tài)性位點將漏掉大量疾病關聯(lián)位點，造成“遺傳度缺失”。

已有報道［7］應用外顯子組測序技術對50個藏族人的外顯子進行測序研究并尋找到與藏族人高原適應性密切相關的候選基因。對200個丹麥人的外顯子測序研究［8］揭示大量低頻率非同義突變的存在，顯示編碼區(qū)包含的低頻有害突變比例比預期大很多，該研究首次證實，影響人類健康和疾病易感性的多態(tài)性位點在人群中往往頻率低，但是相關位點的個數(shù)很多。本課題組的研究顯示存在大量的可能與PDR易感性有關的 SNPs，有一些是已報道的［9-10］，尚有一些SNPs是新發(fā)現(xiàn)的，關于這些SNPs與PDR的關系及在PDR發(fā)生中的作用有待于進一步研究明確。

總之，對50對北方漢族NDR和PDR的2型糖尿病患者的外顯子組測序分析研究顯示，存在大量可能與PDR易感性相關的SNPs，新一代的外顯子組重測序研究將更有助于研究基因易感性與2型糖尿病患者PDR的關系。但還需進一步在大樣本的實驗研究中證實這些SNPs與PDR發(fā)生的關系，并明確其在PDR發(fā)生和發(fā)展中的具體作用機制。

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