聯合應用磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(GPC-3)和細胞角蛋白-19(CK-19)免疫組化檢測在肝細胞肝癌診斷和鑒別診斷中的價值

張世杰 郎振為 王欣欣 呂福東

(首都醫科大學附屬北京佑安醫院病理科，北京 100069)

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3，GPC-3)是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族中的一員，一種癌胚蛋白，表達在胚胎里，發育期間，起到形態形成和生長控制作用［1］。這個家族中有6個成員，從GPC1至GPC6在人體組織中已被識別，GPC-3通過糖基磷脂酰肌醇連接到細胞膜上，在細胞生長和分化中起到重要作用［2］。在胚胎和胎兒期，GPC-3的表達有明顯的器官組織特異性和分化時相特異性。肝實質細胞在整個孕期均有明顯表達，而嬰兒出生后到成人階段，除在胎盤、乳腺、間皮、卵巢、肺及腎組織有弱表達外，其他正常組織無明顯表達［3］。鑒此，本實驗是通過GPC-3的免疫組化在肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)和肝內膽管細胞癌(in-trahepatic cholangiocarcinoma，ICC)中的表達，并結合細胞角蛋白(cytokeratin-19，CK-19)免疫組化染色的結果，探討GPC-3和CK-19聯合應用在診斷和鑒別HCC與ICC中的價值。

1 對象和方法

1.1 對象

收集首都醫科大學附屬北京佑安醫院病理科2009年12月至2011年3月的肝穿刺及外科手術切除的肝癌組織標本142例，其中HCC 94例，ICC 32例，肝細胞癌合并肝內膽管細胞癌(combined hepatocellular and cholangiocarcinoma，CHC)16 例。

1.2 方法

所有標本首先經過10%的甲醛固定，然后切取腫瘤組織按脫水、透明、浸蠟、包埋程序處理，4 μm連續切片，首先進行蘇木素-伊紅(HE)染色，肝癌診斷由病理專業兩位副主任醫師復診，并按 Edmondson—Steiner法，將肝癌分化程度診斷標準分為高分化、中分化、低分化各為 37、80、25 例。

1.3 免疫組化檢測

采用EnVision 2步法，上述切片經烤片、脫蠟，逐級乙醇由高至低至入水，入3%過氧化氫液5 min，PBS緩沖液浸3遍，每遍5 min，放入pH 6.0檸檬酸緩沖液中高溫高壓修復:高壓鍋噴氣后，加熱2 min，變中火2 min，關火后燜10 min，放入冷水中冷卻至37℃，放入PBS緩沖液洗3遍，加GPC-3一抗(鼠抗人單克隆抗體)，4℃冰箱過夜，PBS緩沖液浸3遍，每遍5 min，加二抗PV6000(通用型抗體)37℃ 10 min，PBS緩沖液浸3遍，DAB顯色，PBS液終止染色，乙醇由低至高濃度逐級脫水至入二甲苯，封片。CK-19免疫組化染色步驟同GPC-3基本一樣。不同的只是CK19在高溫高壓修復后，37℃進行1 min胃酶消化，PBS緩沖液洗3遍，加入一抗(鼠抗人單克隆抗體)，后續步驟同GPC-3。

1.4 試劑

GPC-3和CK-19兩種試劑均購自北京中山金橋生物技術有限公司。

1.5 染色結果判斷

GPC-3呈細胞質或細胞膜表達，陽性信號為黃色或棕黃色，計數陽性細胞率作為表達強度評價指標［4］，略微修改:分別為陰性(-)細胞陽性率:＜10%;弱陽性(+):細胞陽性率10% ～30%;陽性(++):細胞陽性率31% ～60%;強陽性(+++):細胞陽性率＞60%。

膽管上皮細胞質染成黃色或棕黃色為CK-19陽性。CK-19表達強度評價指標同GPC-3。

1.6 統計學方法

運用SPSS 13.0軟件對數據資料進行處理，分組等級資料采用Kruskal-Wallis檢驗和兩兩比較的擴展t檢驗。用Kappa系數描述實際疾病分類與預測分類的一致性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GPC-3、CK-19在HCC、ICC和CHC中的表達

94例HCC中，GPC-3陽性表達79例(84.0%)(圖1)，32例ICC中GPC-3陰性表達5例(15.6%)，16例CHC的GPC-3表達均為陽性(100%)(圖2)，3組之間的差別有統計學意義(P＜0.05，表1)。

表1 GPC-3在肝細胞肝癌、肝內膽管細胞癌及肝細胞癌合并肝內膽管細胞癌中的表達Tab.1 Expression of GPC-3 in HCC，ICC and CHC cells n(%)

CK-19在ICC及CHC組織中檢出率分別為96.6%(31/32)及100%(16/16)(圖 3，4)。在 HCC病例中均為陰性。CK-19在ICC和CHC中的表達差異具有統計學意義(P＜0.05，表2)。

2.2 腫瘤分化程度與GPC-3和CK-19檢出及表達程度的關系

高分化的GPC-3傾向于陰性(-)和弱陽性(+)(28.0%，56.0%)，中低分化的GPC-3傾向于強陽性(++，+++)(表3)，但是，表3的結果尚不能提示不同分化程度的GPC-3分布的差別有統計學意義(P＞0.05)。進而分別分析HCC、ICC和CHC中分化程度和GPC-3的關系。在ICC和CHC中不同分化程度的GPC-3的分布差異無統計學意義。

高分化的GPC-3傾向于陰性(-)和弱陽性(+)(25.0%，62.5%)，中低分化的 GPC-3 傾向于強陽性(++，+++)，提示不同分化程度的GPC-3分布的差別有統計學意義(P＞0.05)，詳見表4。

表3 GPC-3與腫瘤分化程度的關系Tab.3 Relationship between differentiation and GPC-3 expression n(%)

表4 HCC中GPC-3與腫瘤分化程度的關系Tab.4 Relationship between the extent of differentiation and expression of GPC-3 in HCC n(%)

高分化腫瘤中CK19的陰性(-)和弱陽性(+)的比例(100.0%)高于低分化和中分化腫瘤中的比例(83.8%，90.1%)(P＜0.05)，詳見表5。

表5 CK-19與腫瘤分化程度的關系Tab.5 Relationship between the extent of differentiation and CK-19 expressionn(%)

2.3 聯合應用GPC-3和CK-19鑒別HCC、ICC 和CHC

HCC、ICC和CHC的鑒別標準為:在肝癌中GPC-3陰性或陽性，且CK19陰性為HCC，預測例數是94例。GPC-3陰性，且CK19陽性為ICC，預測例數是27例。GPC-3陽性，且CK19陽性為CHC，預測例數是21例，詳見表6。

實際疾病分類與預測分類的一致性相當好(Kap-pa=0.888，P=0.000)，準確率是 94.4%，詳見表 7。

表6 GPC-3與CK-19的關系Tab.6 Relationship between the expression of GPC-3 and CK-19 n(%)

3 討論

基于形態學和細胞遺傳學，肝癌被分為3類，肝細胞肝癌(HCC)、肝內膽管細胞癌(ICC)、肝細胞癌合并肝內膽管細胞癌(CHC)。這3種肝腫瘤經常很難區分，GPC-3是一種血清學和組織學上的肝癌標志物［5］。GPC-3在HCC與良性肝病組織的表達差異明顯，在丙型肝炎后肝硬化背景的早期，HCC組織中GPC-3表達100%，其他良性肝病和正常肝組織中表達為0%［6］。繆輝來等［7］研究顯示:肝癌組織GPC-3陽性表達率為81.5%，而癌旁及遠肝癌組織無表達。Di Tommaso L等［8］研究顯示，GPC-3對早期肝癌診斷的敏感性是69%，特異性是91%。在AFP陰性肝癌中，GPC-3也有較高的表達率。Ding G H等［9］檢測了41例AFP陰性的肝癌組織及其癌旁組織的GPC-3 mRNA，癌組織表達率為73.17%，癌旁組織中只有9.76%，且為弱表達。

表7 實際疾病分類與預測分類的比較Tab.7 Comparison of actual disease classification and predicted disease classification

本實驗顯示，GPC-3在肝癌細胞膜上著色，或在細胞質中著色，一般情況是2種著色都有，很少有單一一種著色，細胞質和細胞膜混合表達與生存率沒有相關性［4］。GPC-3只在肝癌細胞上著色，而正常肝細胞及膽管中極少著色;在膽管癌中，只有CK-19在膽管癌細胞及正常膽管細胞中著色，在肝癌細胞中均為陰性。在CHC中，GPC-3及CK-19均在同一部位著色，可能是HCC祖細胞或干細胞既向HCC成分轉化又向ICC成分轉化的結果［5］。GPC-3對HCC和CHC有較高敏感性和特異性，相對于ICC，其敏感性和特異性較低，GPC-3在HCC和CHC的表達與ICC有明顯差異。GPC-3多數在肝細胞成分中表達，在CHC中表達，可能與肝癌祖細胞部分向肝癌細胞成分轉化有關［5］，少數在膽管來源的細胞中表達。

CK-19在ICC和CHC的絕大多數病例中呈陽性表達，而在HCC中均為陰性，表明CK-19僅表達于膽管上皮來源的細胞。在ICC和CHC中不同分化程度的GPC-3的分布差異無統計學意義(P=0.327，P=0.499)。此外，高分化的腫瘤組織中GPC-3表達多為陰性和弱陽性(25.0%，62.5%)，中低分化的 GPC-3多為強陽性，反映出不同分化程度的GPC-3分布的差別無統計學意義(P＞0.05)。這與Shirakawa H等［4］報道的高分化HCC與低分化HCC相對比，GPC-3很少在高分化HCC中表達相一致。GPC-3在中低分化HCC中表達強度明顯高于高分化HCC。而HCC分化程度又與HCC侵襲性相關。提示，GPC-3在HCC中表達強度可能與HCC的惡性程度有關，可能是預后的判斷指標。

綜上所述:聯合應用GPC-3和CK-19在肝細胞肝癌診斷和鑒別診斷中是有一定價值的。

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