腦外傷合并骨折患者骨折愈合過程中血管內皮生長因子在血清和骨痂中的表達

沈 峰 潘海濤 麻 松 曾 崢

(首都醫科大學附屬北京天壇醫院骨科，北京 100050)

臨床工作中醫師發現，當四肢骨折伴隨腦損傷時，骨折處往往可見骨痂過度生長，骨折愈合明顯快于單純的四肢骨折，甚至在肌肉中出現異位骨化。盡管臨床和實驗研究［1-3］均支持中樞神經損傷促進骨折愈合的結論，但其作用機制仍未明確。1990年Bidner S M等［4］研究發現，腦損傷后其血清促骨生長活性增加。從此，體液因素引起了學者們的廣泛關注。國內學者也設計了大量動物模型實驗［5-7］，對體液因素中各種生長因子對于腦外傷合并骨折時促進骨折愈合的可能機制進行了研究，并取得了重要進展。目前國內外有關腦外傷合并骨折病人體液因素及激素水平與骨折愈合關系的相關報道甚少。

本文作者通過酶聯免疫吸附法(ELISA)和免疫組織化學染色，觀察骨折合并腦損傷時人體血清中血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)含量的變化與骨折位點VEGF表達的關系，探討腦損傷合并骨折時骨折愈合加速的機制，以期為臨床應用VEGF等相關因子治療難愈合性骨折提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗于2008年10月至2010年11月在首都醫科大學附屬北京天壇醫院骨科及病理科完成。Olympus顯微鏡、攝影鏡、病理圖像分析系統由北京天壇醫院病理科提供;VEGF多克隆抗體、PV-6000即用型二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)。VEGF酶聯免疫吸附試劑盒由北京嘉美諾斯生物科技有限公司提供。酶標讀板儀(Humanreader，德國)由北京天壇醫院檢驗科提供。

1.2 一般資料

本研究26例腦外傷合并骨折患者及31例單純骨折患者均來自于2008年10月至2010年11月在首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科及骨科住院的患者。57例患者中男36例，女21例，男女比例約為1.7∶1;年齡14 ～62 歲，平均年齡 36.7 歲;手術距受傷時間3～22 d，平均13.2 d。所有患者骨折部位與類型基本相同，均為四肢長管狀骨骨折，腦外傷合并骨折患者均有影像學證實存在顱腦外傷，Glasgow評分5～12分，全部病例無其他神經系統及心、肝、腎嚴重疾患，無血液病，無糖尿病、無骨質疏松及成骨不全。本研究已通過醫院倫理委員會，所有患者已簽署知情同意書。

1.3 方法

1)ELISA法

(1)研究對象分組:將57例患者分成2組，即:單純骨折組(A組、對照組)31例和骨折合并腦外傷組(B組、實驗組)26例。

(2)標本采集和處理:所有病例均在傷后1、2、3、4周時取空腹靜脈血2 mL，血液離心后取血清，置于-70℃保存待檢。

(3)血清VEGF濃度測定:每孔各加入標準品或待測樣品100 μL于空白微孔中，將反應板充分混勻后置37℃孵育反應120 min，用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，每次靜置10～20 s，向濾紙上印干。每孔中加入第一抗體工作液100 μL，將反應板充分混勻后置37℃孵育反應60 min，洗板機清洗4～6次，每次靜置10～20 s，向濾紙上印干。每孔加酶標抗體工作液100 μL。將反應板置37℃孵育反應30 min，洗板機清洗4～6次，每次靜置10～20 s，向濾紙上印干。每孔加入底物工作液100 μL，置37℃暗處反應15 min，每孔加入100 μL終止液混勻。30 min內用酶標儀在450 nm處測吸光值，繪制標準曲線，在標準曲線上查找對應的濃度值。

2)免疫組織化學染色法

(1)研究對象分組:根據手術距受傷時間3～7 d、8～14 d、15～21 d，分別將31例單純骨折組(A組、對照組)和26例骨折合并腦外傷組(B組、實驗組)分為A1(10例)、A2(11例)、A3(10例)組和 B1(8例)、B2(8例)、B3(10例)組。

(2)標本采集和處理:術中切取骨折局部新鮮肉芽組織，經10%中性甲醛固定，石蠟包埋、切片。

(3)免疫組織化學染色:①肉芽組織切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min。② 高壓修復抗原。③分別經3%H2O2室溫孵育5 min消除內源性過氧化物酶的活性，50 mL/L山羊血清封閉非特異性抗原。④滴加第一抗體(VEGF多克隆抗體，工作濃度1∶100)處理，4℃過夜，PBS沖洗，2 min×3次。⑤ 滴加試劑1(polymer helper)，37℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次。⑥ 滴加試劑2(poly peroxidase-antimouse/rabbit IgG)，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次。⑦ DAB顯色。⑧ 蒸餾水充分沖洗，復染。⑨脫水透明、封片。

(4)免疫組化圖像分析:用陽性細胞表達率和目標灰度值進行量化。標本切片置于光鏡下輸入并顯示圖像，每個切片隨機選取4個視野，在同一光強度下進行陽性細胞表達率和灰度值測算。陽性細胞表達率越大，抗體表達越多;灰度值表示陽性細胞內信號的強度，灰度值越小則信號越強，抗體濃度越大。

1.4 統計學方法

使用SPSS 16.0統計軟件對數據進行處理，實驗數據分析以均數±標準差(±s)表示。2組數據比較分別應用重復測量設計的方差分析和t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組患者不同時間點血清VEGF含量比較

A組(單純骨折組)患者血清VEGF含量在傷后2周出現峰值，較B組(腦外傷合并骨折組)高峰出現晚，峰值低，持續時間短。在4周時有明顯下降;B組(腦外傷合并骨折組)患者血清VEGF含量在傷后1周即出現高峰，較A組(單純骨折組)高峰出現早，峰值高，以后雖有所下降但仍維持較高水平，持續時間長，在4周時有明顯下降。傷后1、2、3周時，2組患者血清VEGF含量比較差異有統計學意義(P＜0.05)，4周時2組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，詳見表1。時間主效應的F=14.796，P＜0.01，說明各個時間點的血清VEGF含量有差異;腦外傷主效應的F=12.477，P＜0.01，說明2組間血清 VEGF 含量差異有統計學意義。

表1 A、B組血清VEGF含量Tab.1Level of serum VEGF of group A and B(±s)(pg/mL)

表1 A、B組血清VEGF含量Tab.1Level of serum VEGF of group A and B(±s)(pg/mL)

Group A:group of fracture;Group B:fracture with cerebral trauma group;VEGF:vascular endothelial growth factor.

Group Number of case 1 week 2 week 3 week 4 week A 31 12.98 ±6.30 20.08 ±9.76 16.27 ±8.65 13.41 ±7.85 B 26 27.89 ±12.74 26.31 ±11.14 22.48 ±9.97 14.84 ±6.27 F 32.939 5.070 6.346 0.590 P 0.020 0.012 0.446 0

2.2 2組患者不同時間段VEGF免疫組織化學染色結果比較(陽性表達均呈棕黃色顆粒)

1)鏡下觀察:A組(單純骨折組)3～7 d在肉芽組織中的成纖維細胞、間充質細胞、血管內皮細胞、成骨細胞胞質中均有少量VEGF陽性表達(圖1A)。8～14 d主要在間充質細胞、血管內皮細胞、成骨細胞表達陽性(圖1B)。15～21 d主要在血管內皮細胞、成骨細胞表達陽性(圖1C);B組(腦外傷合并骨折組)3～7 d在肉芽組織中的成纖維細胞、間充質細胞、血管內皮細胞、早期軟骨細胞及成骨細胞胞質中均有廣泛的VEGF陽性表達(圖1D)。8～14 d主要在間充質細胞、血管內皮細胞、成骨細胞表達陽性(圖1E)。15～21 d主要在血管內皮細胞、成骨細胞表達陽性(圖1F)。

2)免疫組織化學染色VEGF陽性細胞表達率:A組(單純骨折組)3～7 d時VEGF有少量表達，隨后逐漸升高，在14 d左右達高峰，在15～21 d時略下降。B組(腦外傷合并骨折組)在受傷后3 d時VEGF即有大量表達，在受傷后7 d達高峰，在15～21 d時仍維持在較高水平。B組(腦外傷合并骨折組)在各時間段，VEGF表達陽性細胞率及灰度值均顯著高于A組(單純骨折組)(P＜0.05)，詳見表2，3。

3 討論

圖1 單純骨折組與腦外傷合并骨折組VEGF免疫組化染色Fig.1 Immunohistochemical staining of VEGF for fracture group and fracture with cerebral trauma group(200×)

表2 A組、B組肉芽組織VEGF陽性細胞表達率Tab.2 The positive expression rate of VEGF in granulation tissue of group A and B(±s)(%)

表2 A組、B組肉芽組織VEGF陽性細胞表達率Tab.2 The positive expression rate of VEGF in granulation tissue of group A and B(±s)(%)

Group A:group of fracture;Group B:fracture with cerebral trauma group;VEGF:vascular endothelial growth factor.

Group 3～7 d 8～14 d 15～21 d A 47.3 ±7.5(n=10) 68.4 ±8.3(n=11) 52.1 ±10.2(n=10)B 89.2 ±9.7(n=8) 83.6 ±9.0(n=8) 77.2 ±9.3(n=10)t 2.826 2.436 2.574 P 0.008 0.015 0

大量臨床病例研究表明，骨折患者若同時伴有腦外傷，其骨折愈合過程明顯加快，甚至在未見骨折的某些關節周圍出現異位骨化現象。早在1968年，FeeneyDM等［8］首次報告腦外傷后出現異位骨化現象，后許多學者對骨折合并腦外傷患者的骨愈合和異位骨化進行了研究。Spencer R F［9］比較了53例合并腦外傷的長骨骨折患者與無腦外傷骨折患者的骨折愈合情況，并對骨痂形成量進行量化，得出了相同結論。關于腦外傷后加速骨折愈合的調節因素，國內外學者［10-14］已開始在分子生物學水平進行研究，并逐漸認識到細胞因子的特殊作用。基礎實驗［5-7，11-14］已證實，VEGF、TGF-β1、bFGF、PDGF、IGF-1 等生長因子均有較強的促進骨折愈合的作用，實驗研究結果提示腦外傷后這些生長因子表達水平升高可能是骨折愈合加速的原因之一。

表3 A組、B組肉芽組織VEGF平均灰度值Tab.3 The gray scale value of VEGF in granulation tissue of group A and B(±s)(%)

表3 A組、B組肉芽組織VEGF平均灰度值Tab.3 The gray scale value of VEGF in granulation tissue of group A and B(±s)(%)

Group A:group of fracture;Group B:fracture with cerebral trauma group VEGF:vascular endothelial growth factor.

Group 3～7 d 8～14 d 15～21 d A 129.43 ±16.84 117.26 ±11.26 122.29 ±13.28 B 102.52 ±10.56 107.43 ±9.77 113.37 ±10.79 t 2.717 2.267 2.686 P 0.001 0.012 0.010

骨折的愈合主要有2種方式:膜內成骨和軟骨內成骨，這是一個極其復雜的生物學過程，大量細胞因子在不同的骨折修復階段發揮不同的作用。血管生成在骨折愈合過程中具有重要意義。新的血管形成可能與諸多因素有關，其中VEGF具有促進血管生成、維持血管功能以及增加血管內皮細胞通透性的作用，故尤為重要。

本研究ELISA實驗中，患者血清VEGF濃度在A、B 2組均發生改變，且均有峰值，并持續一段時間，后逐漸降低。A組(單純骨折組)患者血清VEGF含量在傷后1周含量較少，2周出現峰值，在4周時有明顯下降，這與武永剛等［15］的研究結果相符。他們發現在骨折愈合的不同階段，骨痂中VEGF基因表達的程度不同。他們認為骨折后早期 (5～7 d)骨折局部由于出血、組織細胞壞死、炎性細胞反應引起了血流中斷、此時的VEGF表達量較弱。隨著骨折的修復，肉芽組織的增長加快使得血供相對減少，氧分壓降低，低氧強烈誘導VEGF的表達。大約在骨折后2周VEGF mRNA表達量達到高峰，約為初期的2.4倍。此時恰為軟骨細胞合成高峰期，軟骨痂內迅速形成的新生血管有助于提供前骨祖細胞。而在骨修復的后期，VEGF mRNA的表達呈平穩下滑趨勢。本研究免疫組織化學實驗中，鏡下觀察發現A、B 2組患者骨折局部肉芽組織中均可見新生血管，且新生血管壁可見大量VEGF棕黃色陽性表達顆粒，表明VEGF通過與血管內皮細胞受體結合，具有強大的促血管內皮細胞增生和血管生成的作用。這一作用的結果是為骨折局部帶來了更多的氧，極大地改善了骨折局部的缺氧狀態;為骨折局部更多組織的修復提供營養，運送足量鈣質，促進骨痂形成;為骨折局部帶來更多炎性細胞，其趨化作用使更多細胞因子聚集到骨折局部，為各種生長因子發揮“網絡調節”作用創造了條件，共同促進細胞移行、增生、分化，修復損傷的組織;還可將大量間充質細胞帶入損傷區，間充質細胞進一步轉化為成骨細胞。通過切片觀察，我們可以看到VEGF在B組(腦外傷合并骨折組)患者肉芽組織的早期軟骨細胞及成骨細胞胞質中有廣泛的陽性表達。國外實驗［16］發現，骨折部位的成骨細胞具有 VEGF-1和VEGF-2受體的表達，因此，VEGF可以直接作用于成骨細胞，并可以與之結合，增加其移行和分化功能，使堿性磷酸酶活性增強，局部鈣鹽沉積，促進骨折愈合，并且能夠加速軟骨的鈣化及骨組織的改建過程。另外，我們還可以看到在軟骨化骨生成區域，新生血管壁可見大量VEGF陽性表達顆粒，表明VEGF還可以誘導血管長入軟骨，從而使軟骨內成骨增強，加速骨折愈合，這一結果與Hayami T等［17］通過實驗得出的VEGF誘導血管長入軟骨的結論相似。故我們可以認為VEGF可能在骨生長、骨改建和骨愈合過程中發揮重要作用。

本實驗中我們發現患者血清VEGF含量B組(腦外傷合并骨折組)在1～3周時均顯著高于同一時間點的A組(單純骨折組)(P＜0.05)，峰值提前1周，且峰值持續時間較長;通過比較A、B 2組受傷后3～7 d、8～14 d、15～21 d各個時間段的VEGF陽性細胞率及灰度值，我們發現B組(腦外傷合并骨折組)VEGF表達持續高于A組(單純骨折組)，且表達高峰提前1周左右，表明在人體骨折愈合階段腦外傷這一因素對VEGF表達具有明顯的促進作用，且表現在外周血(血清)和局部(骨折位點)兩方面。鑒于VEGF具有強大的促進血管生成作用，以及在骨愈合過程中的重要作用，我們推測腦外傷加速骨折愈合的作用可能是通過腦外傷促進VEGF表達實現的，并且其他生長因子的促血管生成作用是以其為基礎實現的。目前認為多種生物因子和缺氧為導致VEGF表達的常見因素。VEGF的表達依賴于一些細胞因子和骨折局部的微環境，比如，方海軍等［18］發現 TGF-β1對 VEGF具有促進和抑制雙向調節作用;張忠提等［19］發現外源性bFGF能夠刺激VEGF分泌，bFGF與VEGF有明顯的時間和濃度關系，bFGF可以直接和間接地調節VEGF的表達。而黃書嵐等［20］實驗發現腦外傷后VEGF在患者腦組織中呈陽性表達，顯著高于正常腦組織，成骨細胞在缺氧刺激下，其VEGF mRNA及蛋白表達明顯提高，而且VEGF的表達與缺氧呈劑量依賴關系。國外學者［21］也對顱腦損傷后VEGF的表達情況進行了動物實驗研究，證實了VEGF在創傷性腦組織中的陽性表達，并且VEGF一般在腦缺血后3～8 h開始表達，1～2 d后達最高峰，而顱腦外傷后繼發性病理損害引起的腦組織缺血缺氧正處在這個時期，故腦外傷后缺血狀態是誘導VEGF表達的主要原因，VEGF已被證實是缺氧誘導生長的因子［22］。故我們推測腦外傷合并骨折患者血清中VEGF濃度增高，從而加速骨折愈合的可能原因為:腦外傷后繼發性病理損害引起的腦組織缺血缺氧，誘導腦挫傷灶周圍腦組織VEGF基因表達增高，血液、腦脊液中VEGF濃度升高，通過腦外傷后破壞的血-腦脊液屏障入血，使外周血中VEGF含量增加;受損腦組織直接釋放促有絲分裂活性物質或生長因子(PDGF、TGF-β1、bFGF、IGF-1等)進入血液循環，調節、刺激和促進外周血中VEGF的含量增加。腦外傷合并骨折患者骨折局部中VEGF表達增加，從而加速骨折愈合的可能原因為:血清中濃度升高的VEGF，通過外周血液循環到達骨折局部;腦外傷后抑制或消耗皮質類固醇等抗炎物質的活動，使骨折出血增加，組織缺氧增加，刺激VEGF增加;腦外傷后血清中生長因子含量發生變化，而這些因子隨著血循環到達骨折位點，可以促進VEGF以及多種細胞因子的表達，促進骨折愈合;腦外傷后中樞系統對周圍神經抑制減弱，從而使骨折處骨痂內感覺神經釋放神經生長因子，而神經生長因子與血管內皮細胞上的受體結合，可促進血管內皮增生，刺激產生VEGF。當然VEGF只是多種生長因子網絡中的一員，而各種生長因子間存在相互聯系、相互制約的關系，組成一個復雜的調控網絡，共同調控腦外傷加速骨折愈合的過程，其具體機制尚待進一步研究。

骨折愈合是一個復雜的過程，有多種生長因子參與，并起重要作用，臨床上可以見到一些難治性骨折，如老年人骨折、股骨頸骨折，脛骨中下段骨折等，這些骨折往往由于血供很差，難以愈合。本實驗研究對臨床促進骨折愈合，治療骨折不愈合或延遲愈合有一定的意義。隨著實驗研究的不斷深入，各種生長因子將逐漸應用于臨床，Lattermann C等［23］在動物實驗中發現，在骨折部位應用VEGF腺病毒轉染的方法可促進骨折愈合，提示在不遠的將來，VEGF等相關因子治療難治性骨折將成為可能。

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