紫貽貝酶解多肽體外抗腫瘤活性研究

楊永芳，丁國芳，楊最素，郁 迪，鄭玉寅，李 榮

（浙江海洋學院食品與藥學學院，浙江舟山 316004）

紫貽貝Mytilus edulis隸屬于軟體動物門、雙殼綱、貽貝目、貽貝科，盛產于我國渤海、黃海等海域，在我國北方稱海紅，江浙一帶稱淡菜，是我國主要的養殖貝類，在浙江省嵊泗縣，養殖和加工紫貽貝已成為該地居民的主要經濟來源，而紫貽貝的價格一直以來非常低廉。當前，貽貝的醫療保健作用已得到了普遍的認同，據《本草匯言》載，“淡菜，補虛養腎之藥也”。現代研究表明，貽貝提取物有抗腫瘤、抗衰老、抗病毒和抗菌等功能，具有增加機體免疫能力、降低血脂含量的功效[1-5]。

活性多肽由于具有敏感性高、穩定性好及副作用少等優點，已被用作抗腫瘤藥物開發的一個重要來源。研究已經證實，食物蛋白通過蛋白酶酶解方式，可以得到功能多樣的活性多肽[6-11]，由于貽貝來源非常豐富，而其所具有抗腫瘤活性功能也已得到證實。在此基礎上，本研究通過正交實驗確定胰蛋白酶水解貽貝的最佳酶解條件，并研究酶解多肽的體外抗腫瘤活性，以期為該領域的進一步研究提供科學依據，并且對于進一步研究與開發以貽貝酶解多肽為基礎的功能性食品和藥物，提高貽貝的經濟價值具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

紫貽貝購自浙江省舟山市南珍市場（經浙江海洋學院趙盛龍教授鑒定）；胰蛋白酶購自北京亞太恒信生物科技有限公司；F12和MTT均購自美國Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自美國AMRESCO公司；一抗Bcl-2和SABC試劑盒均購自武漢博士德公司；其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

德國Sartorius AG公司BSA124S型電子天平；上海博迅實業有限公司醫療設備廠SSW型微電腦電熱恒溫槽；上海標本模型廠DS-1型高速組織搗碎機；日本HITACHI公司CF16RXII高速冷凍離心機；上海智誠分析儀器制造有限公司ZHJH-C1209C型超凈工作臺；美國Thermo公司Forma 3111型CO2培養箱；日本OLYMPUS公司倒置顯微鏡；美國Bio-Rad公司酶標儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶解條件優化

選用胰蛋白酶，考慮到A（料液比）、B（pH）、C（加酶量）、D（溫度）和 E（時間）5個因素，每個因素選4個水平進行L16(45)的正交實驗，比較在不同水解條件下的酶解液的水解度和抗腫瘤活性，從而確定最佳酶種及其水解條件。水解工藝如下：

1.3.2 甲醛滴定法測定AAN

參照趙新淮等[12]方法并稍作修改。取20 mL酶解溶液置于燒杯中，加水60 mL，開動磁力攪拌器，用0.05 mol/L氫氧化鈉標準液滴定至pH為8.2。加入10 mL甲醛溶液混勻，再用0.05 mol/L氫氧化鈉溶液繼續滴定至pH為9.2，記下消耗氫氧化鈉標準的毫升數，同時取水80 mL做試劑空白試驗。按下列公式計算AAN含量，AAN含量與水解度成正相關。

式中，X為樣品中氨基氮的含量（g/100 mL）；V1為測定用樣品加入甲醛稀釋后消耗氫氧化鈉標準液（mL）；V2為試劑空白試驗加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準溶液的體積（mL）；V為樣品液取用量（mL）；C為氫氧化鈉標準液的濃度（mol/L）；0.014為氮的毫摩爾質量（g/mmoL）。

1.3.3 細胞培養

選取人前列腺癌細胞DU-145和PC-3細胞（原購自中科院上海細胞庫，由本實驗室傳代保存）、肺癌細胞H1299和胃癌細胞MGC80-3，分別用含10%胎牛血清的F12（DU-145和PC-3）和RM1640（H1299和MGC80-3）培養基于37℃，5%CO2培養箱中培養至對數生長期。

1.3.4 細胞增殖抑制率的測定

采用MTT法進行檢測，參照LIN等[13]的方法稍作修改。取對數生長期的細胞制成懸液，接種至96孔板，每孔200 μL，于5%CO2，37℃貼壁24 h，然后分別加入不同濃度的酶解多肽溶液，每個濃度設3個平行孔，同時設加PBS的對照組，置5%CO2，37℃培養箱中孵育，培養結束后，加PBS洗2遍，然后加MTT繼續培養4 h，吸棄MTT，加DMSO充分震蕩后置酶聯免疫檢測儀在490 nm測吸光度，計算細胞增殖抑制率（IR），按下列公式計算。

1.3.5 細胞形態觀察

采用HE染色方法。將DU-145和PC-3細胞接種在帶有蓋玻片的6孔板上，細胞爬片24 h后，分別加入濃度為1.5 mg/mL的酶解多肽，培養24 h和48 h后，將蓋玻片取出，95%酒精固定15 min。PBS洗2次，蘇木素進行染色，自來水充分水洗，伊紅復染，自來水浸洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察并攝片。

1.3.6 細胞中Bcl-2基因表達測定

采用免疫組化方法。一抗為兔抗人Bcl-2抗體。細胞爬片及樣品作用后的蓋玻片經丙酮固定，雙氧水∶甲醇（1∶50）滅酶后備用。抗Bcl-2的工作濃度均為1：50，生物素化單抗和SABC試劑的工作濃度均為1∶100。實驗過程參照SABC說明書進行，其中以PBS代替一抗作陰性對照。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶及酶解條件的確定

正交試驗因素水平設計及正交試驗結果見表1，方差分析見表2。

表1 胰蛋白酶對紫貽貝酶解工藝條件的正交試驗結果Tab.1 Trypsin orthogonal design and result

表2 方差分析結果Tab.2 The results of variance analysis

從表1、表2可以看出，在5個因素中，以加酶量對肽鍵生成量的影響最大，具有顯著性差異（P＜0.05），各因子對肽鍵含量的影響依次為加酶量＞溫度＞料液比＞時間＞pH，以此為指標確定的最佳酶解工藝為A3B4C2D3E4，即料液比為1：4、pH為8.5、加酶量為1 000 U/g、溫度為45℃、酶解時間為5 h。另一方面，以IR為指標，酶解溫度對其影響最大且具有顯著性差異（P＜0.05），各因子對肽鍵含量的影響依次為溫度＞加酶量＞pH＞料液比＞時間，最佳酶解工藝為A3B3C3D2E1。由于本實驗最終目的是得到抗腫瘤活性較強的酶解液，所以，本實驗取A3B3C3D2E1，即料液比為1：4、pH為8.0、加酶量為1 500 U/g、溫度為40℃、酶解時間為2 h作為酶解條件，得到的酶解物作為下一步實驗用樣品。

2.2 紫貽貝酶解多肽的抗腫瘤活性

采用MTT法檢測上述水解條件下得到的酶解多肽對DU-145、PC-3、H1299和MGC80-3作用24 h后的增殖抑制率，結果見表3。紫貽貝酶解多肽對DU-145細胞的增殖抑制率最大，當濃度為5 mg/mL時，抑制率為50.23%；對PC-3細胞抑制活性較差，濃度為5 mg/mL時，抑制率僅為43.17%；對H1299和MGC80-3細胞幾乎沒有活性；此外，酶解多肽對DU-145和PC-3的抑制活性呈現濃度依賴性，而當酶解多肽的濃度為0.5 mg/mL時，對4種細胞均沒有顯著的增殖抑制效果。

表3 不同濃度酶解多肽對4種腫瘤細胞的增殖抑制率Tab.3 Effect of peptide on proliferation of four kinds of cell lines

2.3 細胞形態學觀察

HE染色結果顯示（圖1、圖2），圖中A為正常的前列腺癌細胞，B為酶解多肽作用24 h后的細胞形態，C為酶解多肽作用48 h后的細胞形態。由圖1、圖2可以看出，正常細胞胞質染色均一，細胞分裂明顯，形態飽滿，細胞核大小不一，核仁數目多。1.5 mg/mL的酶解多肽作用24 h后，細胞質濃縮，胞核開始固縮變小，胞間隙增大部分細胞質出現空泡，有凋亡小體形成。作用48 h后，上述改變加劇，細胞數量明顯減少，胞間隙加大明顯，細胞輪廓模糊，細胞核固縮，破碎，染色質顏色加深。細胞形態學觀察顯示，酶解多肽可以明顯改變2種腫瘤細胞的骨架結構，并且對DU-145和PC-3細胞的活性作用強度具有時效關系。

圖1 DU-145細胞的HE染色（×400）Fig.1 HE staining of DU-145 cells(×400)

圖2 PC-3細胞的HE染色（×400）Fig.2 HE staining of PC-3 cells(×400)

2.4 細胞Bcl-2表達測定

Bcl-2在前列腺癌細胞中通常過量表達，一般其陽性染色主要定位于胞漿，根據陽性率不同表現為淺黃、黃色和黃棕色（圖3、圖4），圖中A為一抗為PBS的陰性對照組，B為樣品加入前Bcl-2的陽性表達，C為樣品加入48h后Bcl-2的陽性表達。由圖3、圖4可知，樣品加入前，DU-145和PC-3細胞中Bcl-2的表達量均呈陽性表達，呈黃棕色；酶解多肽作用后，DU-145和PC-3細胞中Bcl-2的表達量均明顯下降，呈淺黃色。

圖3 Bcl-2在DU-145細胞中的陽性表達（×400）Fig.3 The expression level of Bcl-2 in DU-145 cells（×400）

圖4 Bcl-2在PC-3細胞中的陽性表達（×400）Fig.4 The expression level of Bcl-2 in PC-3 cells（×400）

3 討論

本文首先采用正交實驗方法，以紫貽貝為材料，水解度和腫瘤細胞增殖抑制率為指標，考察了各因素及水平對胰蛋白酶水解的影響。結果顯示，在本實驗所選用的5個因素中，對酶解物的水解度和抗腫瘤活性影響最大的因素不同；當酶解物的水解度和抗腫瘤活性最大時，各因素的水平也不相同。以上結果表明，酶解物的水解度與抗腫瘤活性之間沒有正反相關性，抗腫瘤活性的大小只與酶解物的組成成份相關，這與先前GUO等[14]的研究結果相似。由于因素中各水平的輕微變化會最終改變酶解物的活性功能，因此，在生產目標肽的水解過程中，應嚴格控制生產條件，以保證目的肽的獲得及實驗的可重復性。其次，本實驗研究了最佳水解條件下得到的酶解多肽對4種腫瘤細胞的增殖抑制活性，結果表明，該肽只對前列腺癌細胞系的DU-145和PC-3表現出了強的活性，而對胃癌，肺癌等腫瘤細胞沒有顯著活性。據此推測，本研究所得的多肽對前列腺癌具有特異性抑制作用，可能是通過作用于其特異性基因而達到抑制效果的，而HE染色顯示，多肽作用后的2種腫瘤細胞均出現明顯的凋亡小體，多肽對2種細胞的作用機制之一可能是通過凋亡途徑實現。

Bcl-2是目前公認的抗凋亡基因，在細胞周期中起到維持細胞增殖與凋亡相互平衡的作用，研究證明[15]，Bcl-2的過量表達與前列腺癌的發生有關，并且它可與Bax、FasL和Fas等基因協同作用，參與了前列腺癌的發生和發展。另有研究表明[16]，Bcl-2的高表達與激素依賴性前列腺癌向激素非依賴性前列腺癌的轉化以及前列腺癌治療過程中出現的抵制現象具有十分密切的關系。因此，抑制Bcl-2的表達，不但可以有效控制前列腺癌的發生、發展和轉移，還可以提高前列腺癌治療效果。本研究得到的紫貽貝酶解多肽，可以顯著地降低Bcl-2的表達，誘導DU-145和PC-3凋亡，因此，可將此肽作為抗前列腺癌藥物或輔助藥物進行開發。但是，本研究中多肽在低濃度時幾乎沒有活性，在高濃度時才顯示出顯著活性，這可能是由于樣品中含有過多的無活性雜質導致的，所以，為了提高其活性效果，降低作用濃度，進一步的分離純化也是十分必要的。

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