不同質量濃度的黃芪總黃酮對高糖培養下牛視網膜血管周細胞氧化應激的影響

江 紅 匡洪宇 馬麗麗 朱雪磊 段 鵬 康英英

哈爾濱醫科大學附屬第一醫院（黑龍江哈爾濱150001）

糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病最常見的嚴重微血管并發癥，可導致失明。其發病機制尚不明確，研究認為在DR中早期周細胞丟失是周細胞發生了凋亡，氧化應激可能誘導周細胞的凋亡。目前研究認為氧化應激是高糖誘導周細胞胞凋亡的中心環節[1]。本實驗通過研究高濃度葡萄糖下培養的牛視網膜微血管周細胞凋亡情況，探討黃芪有效部位的提取物——黃芪總黃酮對牛視網膜微血管周細胞凋亡及凋亡基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物 取黃芪10kg，以95%乙醇減壓回流提取3次，合并，濃縮至浸膏，取浸膏加蒸餾水溶解，用醋酸乙酯萃取數次，合并萃取液，濃縮，過柱，得總黃酮，提取物由黑龍江中醫藥大學藥理學實驗室鑒定。臨用前以磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋至所需濃度。

1.2 試劑與儀器 DMEM培養基（低糖，美國Hyclone公司），優級胎牛血清（天津灝洋生物公司），膠原酶Ⅱ型（美國Invitrogen公司），雙抗（大連美羅大藥廠），胰酶、多聚賴氨酸、單克隆抗體及免疫組化試劑盒（武漢博士德生物公司），超氧化物歧化酶測試盒（南京建成生物工程研究所）、丙二醛測試盒（南京建成生物工程研究所）、正常熔點瓊脂糖（西班牙Biowest公司）、低熔點瓊脂糖（德國Merck-Darmstadt公司）。熒光顯微鏡，DYY-32型電泳儀以及細胞培養相關材料。

1.3 視網膜毛細血管周細胞的原代培養 培養方法參照文獻[3]。分離胎牛眼視網膜，勻漿，0.2%膠原酶37℃消化40min，200目篩網過濾，離心，加入含20%胎牛血清DMEM培養液，接種入50cm培養瓶中，在37℃含5%CO2及90%濕度培養箱中培養。倒置相差顯微鏡觀察細胞生長形態，再去除培養液，烤干后采用鼠抗α平滑肌肌動蛋白抗體及兔抗神經膠質纖維酸性蛋白抗體，進行視網膜血管周細胞免疫組化鑒定。

1.4 分組培養 取體外培養3代融合的周細胞，用培養液配成單個細胞懸液，調整細胞密度為1×107/L，接種于96孔培養板內。細胞貼壁后更換不同濃度的葡萄糖培養液。對照組加入含20%胎牛血清的DMEM（5.5mmol/L）；模型組加入葡萄糖培養液（25mmol/L）；黃芪總黃酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組先加入葡萄糖培養液（25mmol/L），再分別加入 0.25、0.5、1.0、2.0mg/mL 的黃芪總黃酮孵育6d。

1.5 超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量檢測SOD活力測定采用黃嘌呤氧化酶法；MDA測定采用硫代巴比妥酸比色法。取周細胞培養上清50μL，按照試劑盒說明進行，使用722可見分光光度計測定吸光度，SOD活力及MDA含量。

1.6 統計學處理 應用SPSS 10.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析及直線相關回歸分析方法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察，原代培養的BRPs 1～2d后貼壁，貼壁后逐漸伸展，呈不規則多角形，胞體不大，可見突起，生長較快，1～2周BRPs可達到融合，細胞密集，無接觸性抑制。α平滑肌肌動蛋白抗體染色顯示BRPs胞漿內呈特異性棕黃色著色，陽性率達99%以上，兔抗神經膠質纖維酸性蛋白抗體免疫組織化學染色BRPs胞漿不著色。

2.2 黃芪總黃酮對周細胞MDA及SOD的影響 與模型組相比，黃芪總黃酮各組周細胞MDA含量降低、SOD活力減弱（P＜0.01）；并隨著黃芪總黃酮質量濃度的增加，MDA含量降低呈現一定的劑量-效應關系，差異具有統計學意義（P＜0.01）。而SOD活力并無明顯的劑量依賴性。黃芪總黃酮各組MDA/SOD減小，與模型組相比差異具有統計學意義（P＜0.05）；并隨著黃芪總黃酮濃度的增加，呈現一定的劑量-效應關系，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

視網膜組織是眼睛的多層感覺組織，富含多不飽和脂肪酸，它對ROS和脂質過氧化物特別敏感.自由基活性增強和抗氧化能力降低是DR發生的重要機制。研究證實抗氧化劑的應用不僅能抑制氧自由基誘導的細胞凋亡，而且能防止糖尿病微血管并發癥的發生[3]。

表1 各組MDA含量及SOD活性比較 （±s）

表1 各組MDA含量及SOD活性比較 （±s）

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與黃芪總黃酮Ⅰ組比較，▲P＜0.01；與黃芪總黃酮Ⅱ組比較，#P＜0.01；與黃芪總黃酮Ⅲ組比較，○P＜0.01。

SOD（U/mL） MDA/SOD組 別對照組模型組MDA（nmol/L）2.17±0.27 7.42±1.11**10.43±1.01 0.21±0.02 21.92±1.06** 0.34±0.04*黃芪總黃酮Ⅰ組 7 7.11±0.71** 20.62±0.63** 0.33±0.44*黃芪總黃酮Ⅱ組 7 5.74±0.46**△△▲ 18.46±0.59**△△▲ 0.31±0.03*△黃芪總黃酮Ⅲ組 7 4.77±0.28**△△▲# 16.04±0.48**△△▲# 0.29±0.02*△黃芪總黃酮Ⅳ組n 7 7 7 3.01±0.16**△△▲#○13.36±0.26**△△▲#○ 0.22±0.01△▲

黃芪具有改善循環、降糖、抗氧化、抗衰老、調節免疫等多種功效，已有臨床研究證實以黃芪為主要成分的中藥顆粒對保護周細胞、防止周細胞消失及基底膜增厚有較好療效。黃芪總黃酮是黃芪有效部分提取物，實驗表明其可降低細胞脂質過氧化物的生成，直接清除羥自由基和超氧陰離子自由基，提高SOD細胞活性，對自由基所致細胞膜、蛋白質以及DNA損傷有明顯的保護作用。而最近研究發現黃芪總黃酮具有抗突變、抗腫瘤和抑制動脈粥樣硬化等多種生物學效應[4]。

本研究用其進行體外細胞試驗，觀察了黃芪總黃酮對體外培養牛視網膜微血管周細胞氧化應激的影響。結果顯示一定質量濃度的黃芪總黃酮對高糖培養下的牛視網膜微血管周細胞氧化應激有明顯的抑制作用，且隨著黃芪總黃酮質量濃度的增加，周細胞的氧化損傷降低。結果提示黃芪總黃酮對視網膜血管周細胞有一定保護作用，是一種很有前途的臨床抗氧化劑。（第一作者現在黑龍江省醫院工作）

[1]Rolo A P，Palmeira CM.Diabetes andmitochondrial function：role of hyperglycemiaand oxidativestress[J].ToxicolApplPharmacol，2006，212（12）：167-178.

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[3]Mohr S，Xi X，Tang J，etal.Caspase activation in retinasof diabetic andgalactosemicmice and diabetic patients[J].Diabetes，2002，51（6）：1172-1179.

[4]汪德清，田亞平，向蘭.黃芪總黃酮生物學活性作用的化學成分基礎研究[J].軍醫進修學院學報，2006，27（1）：13-15.