左乙拉西坦與拉莫三嗪對海馬細胞保護的對比研究

雷 軍,張占萍,鐘雨秋,王為民

顳葉癲癇占所有癲癇類型的30%～35%,常為難治性癲癇,其結(jié)構(gòu)特征為海馬硬化[1],而細胞凋亡是顳葉癲癇海馬神經(jīng)元丟失導(dǎo)致海馬硬化的重要途徑[2]。本研究比較新型抗癲癇藥物拉莫三嗪和左乙拉西坦對戊四氮致癇大鼠海馬細胞凋亡的影響,對比兩者對海馬細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 普通級健康成年雄性Wistar大鼠,體重260 g～300 g,蘭州大學(xué)實驗動物中心提供。110只Wistar大鼠按體重隨機分為正常組、模型組、陽性藥物對照組(丙戊酸低、中、高劑量組)、治療組 1(拉莫三嗪低、中、高劑量組),治療組2(左乙拉西坦低、中、高劑量組)共 11組,每組 10只。

1.1.1 試劑及藥物 戊四氮由美國Serva公司生產(chǎn)。免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。丙戊酸鈉由湖南湘中制藥有限公司生產(chǎn)。拉莫三嗪由葛蘭素史克公司生產(chǎn)。左乙拉西坦由比利時聯(lián)合化工生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 癲癇模型制備 模型組、各陽性藥物對照組和各治療組大鼠每天腹腔注射戊四氮35 mg/kg,并觀察其行為學(xué)變化30 min。行為學(xué)判斷按 Racine分級法[3],Ⅰ級:濕狗樣顫動,面肌抽動、咀嚼;Ⅱ級:節(jié)律性點頭;Ⅲ級:前肢陣攣;Ⅳ級:站立伴前肢陣攣;Ⅴ級:失平衡、傾倒、四肢抽動、全身陣攣。以連續(xù)出現(xiàn)3次Ⅳ級以上發(fā)作作為點燃標(biāo)準,正常組給予同體積生理鹽水腹腔注射。全部點燃后,按丙戊酸、拉莫三嗪和左乙拉西坦人的最大推薦劑量(丙戊酸鈉3 000 mg/d,拉莫三嗪600 mg/d,左乙拉西坦4000 mg/d)的1/30,1/20,1/10分別為丙戊酸、拉莫三嗪和左乙拉西坦低、中、高劑量組,即丙戊酸低劑量組[100 mg/(kg?d)],中劑量組[150 mg/(kg? d)],高劑量組[300 mg/(kg? d)];拉莫三嗪低劑量組[20 mg/(kg? d)],中劑量組[30 mg/(kg? d)],高劑量組[60 mg/(kg? d)];左乙拉西坦低劑量組[130 mg/(kg?d)]中劑量組[200 mg/(kg?d)]高劑量組[400 mg/(kg?d)]。模型組、正常對照組給予同體積生理鹽水。丙戊酸、拉莫三嗪和左乙拉西坦配制方法及動物給藥:丙戊酸、拉莫三嗪和左乙拉西坦用生理鹽水配成所需濃度;大鼠給藥容積1 ml/100 g,每天灌胃給藥一次,共 3周。

1.2.2 取材和制片 藥物治療3周結(jié)束后各組大鼠進行心臟灌注固定,取海馬組織。將組織塊用4%中性甲醛固定4 h后,在20%的蔗糖中過夜,常規(guī)制作蠟塊,切片。

1.2.3 免疫組化檢測 每只大鼠取2張腦片,分別用于bax,bcl-2檢測。免疫組化染色采用S-P法。Bax、Bcl-2陽性細胞為細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒,陰性對照細胞核染為藍色且細胞核或胞漿內(nèi)無棕黃色顆粒。

1.2.4 圖像分析和數(shù)據(jù)處理 每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野(×400)計數(shù)Bax、Bcl-2陽性細胞數(shù),然后求其平均值進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0軟件進行處理,檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示,組間比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學(xué)觀察 行為學(xué)按Racine法[3]分級判斷:正常組無癲癇發(fā)作;模型組在注射戊四氮后3 min～6 min出現(xiàn)眨眼、動須、節(jié)律性點頭、肢體抽搐及跌倒等。多為Ⅳ級～Ⅴ級,部分出現(xiàn)強直陣攣,甚至出現(xiàn)前、后肢伸肌強烈收縮,同時伴有喉鳴、口鼻流出血性泡沫、肢端青紫等。各陽性藥物對照組、各治療組在注射戊四氮后3 min～8 min出現(xiàn)眨眼、動須、節(jié)律性點頭、肢體抽搐等,多數(shù)表現(xiàn)為Ⅲ級～Ⅳ級,少數(shù)為Ⅴ級而且僅表現(xiàn)跌倒,個別出現(xiàn)強直陣攣。行為學(xué)觀察結(jié)果顯示正常組沒有癲癇發(fā)作,各陽性藥物對照組與模型組比較發(fā)作開始時間延遲,發(fā)作級別下降;拉莫三嗪各組和左乙拉西坦各組與模型組比較發(fā)作開始時間未見延遲,發(fā)作級別未見下降。

2.2 免疫組化結(jié)果 在模型組中,Bcl-2和Bax表達都增加,陽性藥物對照各組和治療各組與模型組比較Bcl-2表達增加和Bax表達減少,說明左乙拉西坦、拉莫三嗪和丙戊酸都具有通過Bcl-2表達增加和Bax表達下降來抑制凋亡的作用,其中左乙拉西坦和拉莫三嗪抑制凋亡的作用隨劑量的增加作用增強,其中,低劑量組中,左乙拉西坦優(yōu)于拉莫三嗪和丙戊酸,而后兩者基本相同,中、高劑量組中,左乙拉西坦和拉莫三嗪均優(yōu)于丙戊酸,而拉莫三嗪和左乙拉西坦基本相同。模型組與正常組比較Bax陽性細胞數(shù)增加,而Bcl-2陽性細胞數(shù)也增加(P＜0.01);各陽性藥物對照組和各治療組分別與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。詳見表 1。

表1 拉莫三嗪對大鼠海馬Bcl-2和Bax表達的影響(±s)

表1 拉莫三嗪對大鼠海馬Bcl-2和Bax表達的影響(±s)

組別 Bax Bcl-2正常組 9.91±0.34 9.94±0.44模型組 19.96±0.291) 20.30±0.521)丙戊酸低劑量組 17.09±0.372) 22.53±0.542)丙戊酸中劑量組 13.90±0.292) 25.08±0.482)丙戊酸高劑量組 11.18±0.652) 30.15±0.512)拉莫三嗪低劑量組 16.90±0.682) 22.84±0.462)拉莫三嗪中劑量組 13.49±0.432) 25.56±0.402)拉莫三嗪高劑量組 10.45±0.422) 31.02±0.272)左乙拉西坦低劑量組 15.18±0.302)3) 24.21±0.472)3)左乙拉西坦中劑量組 13.50±0.382) 25.49±0.372)左乙拉西坦高劑量組 10.26±0.362) 31.14±0.332)與正常組相比,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.01;與 拉莫三嗪組比較,3)P＜0.05

3 討 論

顳葉癲癇典型的病理改變包括神經(jīng)細胞丟失,苔蘚纖維芽生和膠質(zhì)細胞增生,其中細胞凋亡是顳葉癲癇海馬神經(jīng)元丟失重要的途徑[2]。

凋亡總體上有兩種途徑即內(nèi)源性途徑和外源性途徑,內(nèi)源性途徑是通過調(diào)節(jié)線粒體釋放細胞色素C來激活CASPASE9,外源性途徑是通過激活細胞表面受體如FAS來激活CASPASE8或者CASPASE10[4],tBid(truncated Bid)提供內(nèi)源性和外源性途徑的連接[5]。決定是否處于凋亡狀態(tài)的一個重要的因素是Bcl-2家族促凋亡成員如Bax,Bak等和抗凋亡成員如Bcl-2,Bcl-xl之間的平衡[2],同時Bcl-2家族也是癲癇發(fā)作引起的腦細胞凋亡的主要調(diào)節(jié)因素,通過下調(diào)抗凋亡成員Bcl-2和上調(diào)促凋亡成員 Bax來促凋亡[6]。本實驗中,模型組中 Bcl-2和Bax表達都增加,說明機體處于凋亡狀態(tài)時隨著促凋亡成員Bax的表達增強,抗凋亡成員Bcl-2也表達增強,而各陽性藥物組和各治療組表現(xiàn)為Bcl-2表達增加Bax表達減少,說明左乙拉西坦、拉莫三嗪和丙戊酸都可以通過增加抗凋亡成員Bcl-2的表達和減少促凋亡成員Bax表達來起到抑制凋亡,保護海馬細胞的作用。

左乙拉西坦、拉莫三嗪和丙戊酸目前已廣泛應(yīng)用于癲癇的治療,其具有抗癲癇和神經(jīng)保護雙重作用[7]。本實驗中,丙戊酸使戊四氮點燃的慢性癲癇大鼠發(fā)作起始時間延遲,發(fā)作級別有下降趨勢,未出現(xiàn)強直陣攣;而左乙拉西坦和拉莫三嗪對戊四氮點燃的慢性癲癇模型無抗抽搐作用,但三者對大鼠海馬區(qū)細胞Bcl-2表達增加和Bax表達減少與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義,都有抑制凋亡的作用從而起到神經(jīng)保護作用。其中,左乙拉西坦在各種劑量,拉莫三嗪在中高劑量時對大鼠海馬區(qū)細胞Bcl-2表達增加和Bax表達減少與丙戊酸比較具有統(tǒng)計學(xué)意義。左乙拉西坦、拉莫三嗪在抑制細胞凋亡,神經(jīng)保護方面優(yōu)于丙戊酸,推測與左乙拉西坦和拉莫三嗪存在獨立于抗癲癇作用的神經(jīng)保護作用相關(guān)[8,9]。同時左乙拉西坦低劑量應(yīng)用即顯示出抗凋亡神經(jīng)保護作用,而拉莫三嗪在中高劑量時與左乙拉西坦具有相似的神經(jīng)保護作用,作為神經(jīng)保護劑應(yīng)用中注意劑量的選擇。

本實驗也證實兩藥具有確切的抗海馬細胞凋亡,神經(jīng)保護作用,相信左乙拉西坦及拉莫三嗪作為神經(jīng)保護劑具有很好的發(fā)展前景。

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