腦出血后Eprin-b3的表達與白質損傷的相關性

羅 崗,李東芳,賈曉濤,劉正姣

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是常見的腦血管疾病,隨著我國人口老齡化進程的加快,腦出血患者的發生率、致殘率、死亡率明顯升高 。在腦出血的患者中,50%以上主要是大腦基底節區的出血,而基底節區主要由白質組成,因此,腦出血后主要損傷的是大腦白質。腦白質主要由神經纖維組成(樹突、軸突、膠質細胞),其在神經系統中起著傳遞信息,分泌和支撐神經元等作用,因此,腦白質損傷(神經纖維的斷裂、變性和壞死)對機體會產生十分不利的影響。髓鞘相關抑制因子(mylinassociated inhibitor factors,M AIFs)的發現及對其作用機制的研究成為近年研究的熱點。尤其是它的一個新成員——Ephrin-b3的重要作用成為目前關注的焦點,既往在腦梗死方面有研究,但在腦出血未見相關報道。有研究發現[1]Ephrin-b3表達于髓鞘少突膠質細胞,其抑制活性等同于p75介導的Nogo-66,M AG,OMgp的活性,所以以Ephrin-b3為切入點,觀察成年大鼠腦出血后其與腦白質損傷的相關性,對于中樞神經系統(CNS)再生具有重要意義。本研究采用自體血注入法應用HE染色法,觀察血腫周圍組織學的變化,并測定對照組和實驗組不同時間點血腫周圍Ephrin-b3的表達,探討他們之間的關系,為腦出血的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 選用成年健康雄性Wistar大鼠48只(山西醫科大學生理系動物試驗中心提供),營養中等,鼠齡(3～4)個月,體重250 g±15 g。Ephrin-b3試劑盒(太原市萊爾生物科技有限公司);普通試劑由山西醫科大學實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 本實驗隨機分為對照組和實驗組,對照組分為正常對照組(A組)、假手術組(B組),每組各8只;實驗組為6 h,24 h,48 h,72 h,7 d腦出血組,分別記為D組,E組,F組,G組,H組,每時相點各8只大鼠,每時相出血組分別向大鼠大腦內囊部注射自體血100μL。

1.2.2 模型制作 大鼠術前12 h禁食,可自由飲水。參照Xue等[2]方法制備大鼠模型。用微量注射器自尾動脈分2次取自體非肝素不凝血,每次 50 μ L,共計100 μ L[3,4]。以大鼠腦切片中有明顯的圓形、橢圓形或不規則血腫存在,血液無針道反流,無蛛網膜下腔出血,無血腫破入腦室者為模型成功標準,術后昏迷或死亡者剔除。符合模型成功標準的48只。

1.2.3 標本制備 腦出血各時相組,對照組分別在出血模型建立成功后的 6 h,24 h,48 h,72 h,7 d后,頸椎脫臼處死,迅速取腦,各組隨機取兩只大鼠腦組織迅速固定,石蠟包埋后,在內囊部位做冠狀位切片,厚約5 μ L,HE染色,觀察組織學變化。

1.2.4 腦組織勻漿制備與指標的檢測 將腦組織用生理鹽水漂洗,去除表面血液,濾紙拭干,精確稱重后制備10%勻漿。低溫離心機將勻漿以3 500 r/min離心15 min,取上清液檢測Ephrin-b3,嚴格按照試劑盒提供的步驟進行測定。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件,計量資料用均數±標準差(±s)表示,采用方差分析,進行兩兩比較LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 光鏡下HE染色 HE染色病理觀察,出血6 h組于血腫周圍可見變性壞死區域,細胞排列不整齊,核形態不整,部分核皺縮、髓質均可見片狀間質水腫,但未見炎性細胞浸潤。出血24 h組除可見變性壞死區域擴大外,細胞周圍出現空白區,細胞分布不均勻,神經元細胞數減少,可見散在淋巴細胞浸潤。出血72 h組可見組織水腫明顯,神經元細胞數明顯減少,可見細胞崩解小體,中性粒細胞及淋巴細胞浸潤,可見中性粒細胞附壁現象。假手術組和正常對照組未見異常變化。

2.2 各組大鼠不同時間點Ephrin-b3水平 大鼠腦出血后6 h血腫周圍Ephrin-b3的表達較正常增多,24 h,48 h表達逐步增高,72 h表達達到高峰,與相應時間點假手術組和正常組比較,有統計學意義(P＜0.01),出血7 d組與假手術組和正常對照組比較無統計學意義。詳見表1。

表1 腦出血后不同時間點實驗組Ephrin-b3的表達(±s)

表1 腦出血后不同時間點實驗組Ephrin-b3的表達(±s)

組別 n Ephrin-b3 A組 6 0.124±0.013 B組 6 0.148±0.006 C組 6 0.306±0.0091)2)D組 6 0.519±0.0171)2)3)E組 6 0.778±0.0251)2)3)4)F組 6 1.469±0.0341)2)3)4)5)G組 6 0.136±0.0373)4)5)6)與A組比較,1)P＜0.01;與B組比較,2)P＜0.01;與C組比較,3)P＜0.01;與D組比較,4)P＜0.01;與E組比較,5)P＜0.01;與F組比較,6)P＜0.01

3 討 論

腦出血損傷主要是基底節區腦白質的損傷,病理改變表現為局灶性血腫周圍白質囊性變、凝固性壞死或彌漫性神經膠質細胞(oligodendrocyte,OL)凋亡、壞死[5,6]。本研究發現,實驗組在出血6 h后血腫周圍可見變性壞死區域,出血24 h組除可見變性壞死區域擴大外,細胞周圍出現空白區,出血72 h組可見組織水腫明顯,神經元細胞數明顯減少,可見細胞崩解小體,中性粒細胞及淋巴細胞浸潤,可見中性粒細胞附壁現象。上述改變最重要的病理生理為血腫本身的變化及血腫周圍的繼發性損傷,其機制已比較清楚,但針對白質損傷后的治療措施卻甚微,既往腦出血方面主要針對出血后的影響血腫擴大的相關因素進行研究,而對于神經細胞凋亡過程中分泌的神經生長抑制因子未予足夠重視,因而人們開始逐漸將重點轉向了對血腫周圍神經細胞的研究[7]。髓鞘相關抑制因子(mylin-associated inhibitor factors,M AIFs)的發現及對其作用機制的研究成為近年研究的熱點。尤其是它的一個新成員Ephrin-b3的重要作用成為目前關注的焦點,既往在腦梗死方面有研究,但在腦出血未見相關報道。Eph是新發現的酪氨酸蛋白激酶(RTK)家族中最大的分支,其分布廣泛,結構上高度保守,參與神經系統細胞間相互作用,并與軸突發育路徑有關;Ephrin-b3是Eph家族的重要成員之一。成年時期,主要分布在突觸和神經纖維的少突膠質細胞中,是一種神經纖維生長抑制因子,在突觸重塑和神經的再生過程中有重要的意義[8]。Benson等[9]提出Ephrin-b3是一種髓鞘相關抑制因子,僅表達限于中樞神經系統髓鞘少突膠質細胞;對Nogo,M AG,OMgp,p75基因敲除小鼠的皮質脊髓束再生抑制發揮作用是另一個重要機制。Yiu等[10]發現Ephrin-b3和NgR1/p75一樣都可以激活小GTP酶RhoA,引起生長錐的塌陷,表明他們有共同的信號途徑,也充分說明了Ephrin-b3在中樞神經系統再生抑制中的重要作用。本實驗采用Elisa法定量檢測腦出血后血腫周圍組織Ephrin-b3的表達水平,結果顯示出血周圍組織的Ephrin-b3在出血后6 h開始升高,72 h達到高峰,7 d基本上恢復到正常水平,但仍高于正常水平,與HE染色觀察到血腫周圍組織損傷程度時間一致,提示Ephrin-b3參與了腦出血過程中神經細胞損傷,其表達與腦出血后白質損傷具有相關性。

本研究結果可以得到一個啟示,如果能夠進一步拮抗Ephrin-b3的作用,則可以從減少生長錐塌陷和減少細胞凋亡兩個方面減輕神經細胞損傷及促進再生,為腦出血治療提供實驗依據。

[1]Benson MD,Romero MI,Lush ME,et al.Ephrin-B3 is a myelinbased inhibitor of neurite out growth[J].PNAS,2005,102(30):10694-10699.

[2]Xue M,Del Bigio M R.Intracortical heamorrhage injury in rats:Relationship between blood fraction and brain cell death[J].Stroke,2000,31:1721-1727.

[3]Xi G,Keep RF,Hoff JT,et al.Erythrocytes and delayed brain edema formation following intracerebral hemorrhage in rats[J].J Neurosurg,1998,89:991-996.

[4]周中和,曲方,何祥,等.一種改良大鼠自體血腦出血模型:二次注血/退針法[J].中國臨床神經科學,2004,12(4):406-408.

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[7]Del Bigio M R,Yan HJ,Xue M.Intracerebral infusion of a secondgeneration ciliary neurotrophic facto r reduces neuronal loss in rat striatum following ex perimental intracerebral hemorrhage[J].J Neurol Sci,2001,192(1-2):53-59.

[8]Dalva M B,Takasu MA,Lin MZ,et al.EphB receptors interact with NMDA receptors and regulate by in vivo functional imaging[J].J Neurosci,2000,20(15):5841-5847.

[9]Benson MD,Romero MI,Lush ME,et al.Ephrin-B3 is a myelinbased inhibitor of neurite outgrowth[J].PNAS,2005,102(30):10694-10699.

[10]Yiu G,He Z.Signaling mechanisms of the myelin inhibitors of axon regeneration[J].Curr Opin Neurobiol,2003,13(5):545-551.