ROCK抑制劑對腦出血大鼠腦白質損傷的影響

劉正姣,李東芳,賈曉濤,羅 崗

腦出血后神經元及神經纖維的損傷是影響腦出血患者病情程度及預后的主要因素。成年動物CNS軸突受損后不能再生的主要原因是CNS髓鞘中含有髓鞘抑制因子,髓鞘抑制因子是通過活化Rho蛋白家族成員之一 RhoA這一共同分子開關信號通路,引起一系列的反應,最終導致生長錐的潰變,從而抑制軸突再生。在己辨明的6個RhoA下級分子中,只有ROCK與軸突再生有關,因此,ROCK可能是CNS髓磷脂中各種軸突生長抑制性蛋白發揮作用的集中點[1]。鹽酸法舒地爾(Fasudil hydrochloride)是目前臨床唯一應用的 ROCK選擇性抑制劑[2,3],能通過抑制 ROCK蛋白的表達,抑制Rho/ROCK信號轉導通路的活化,從而減輕髓鞘抑制因子和膠質疤痕對神經再生的抑制。Satoh等[4]研究表明,ROCK抑制劑在缺血性腦卒中能夠抑制腦缺血所導致的神經元死亡,但以往對出血性腦血管病腦損傷的保護作用研究較少。本實驗通過大鼠腦出血模型,應用鹽酸法舒地爾進行干預,觀察比較其對腦出血大鼠神經功能缺損評分、血腫周圍腦組織含水量及腦組織病理變化情況,探討ROCK抑制劑對腦出血后神經損傷可能的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物和主要試劑 雄性 Wistar大鼠96只,體重250 g±15 g,購于山西醫科大學生理實驗室。將其分為3組:假手術組(n=36)、腦出血組(n=36)、鹽酸法舒地爾治療組(n=24)。假手術組和腦出血組選6個觀察時點分別為手術前及手術后6 h、24 h、48 h、3 d、7 d。鹽酸法舒地爾治療組選4個時點分別為手術前及手術后48 h、3 d、7 d。每個時點均為6只動物。鹽酸法舒地爾注射液購自天津紅日藥業股份有限公司;立體定位儀(江灣型)由山西醫科大學生理實驗室提供。固綠FCF購自上海如吉生物科技發展有限公司;變色素2R購自上海源葉生物科技有限公司;磷鎢酸購自江西東太科技有限公司。蘇木精、無水乙醇、冰醋酸等常規試劑由山西醫科大學寄生蟲實驗室提供。

1.2 動物模型制作方法及模型成功標準 采用立體定向大鼠自體血注入內囊建立模型。模型成功標準,參照Zea Longa 5分制評分標準,大鼠清醒后評分。

1.3 神經功能障礙評分 造模成功后運用Bederson[5]大鼠神經功能缺損評分方法進行評分。總分為8分。

1.4 藥物干預 按60 kg體重的人鹽酸法舒地爾注射液治療用量90 mg/d與大鼠換算,則大鼠用量為9.45 mg/(kg?d),人和大鼠間按體表面積折算的等效劑量比值為6.3,再將靜脈注射轉變為腹腔注射為(11.15～11.81)mg/(kg?d)。治療組于出血后24 h開始給藥,1次/天,直到相應時點。ICH組腹腔注射等體積生理鹽水,1次/天,直到相應時點。假手術組手術過程除不注入自體血外,其余條件同ICH組完全一致。

1.5 血腫周圍腦組織水分含量測定 采用干濕法測定含水量。達相應時點處死動物,迅速開顱取血腫周圍組織 2塊(約1 mm3),用萬分之一克精度電子天平(德國Sartorius公司生產BP221s)稱重,然后置于電熱恒溫烤箱,恒溫105℃24 h烤至恒重,后置于干燥密閉容器內使其降至室溫。按Elliott公式計算腦組織含水量:含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6 標本采集 達相應時點處死動物,開顱取出腦組織,甲醛固定,石蠟包埋,切片。行改良三色染色法染色[6]。

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件處理。計量資料以均數±標準差(±s)表示。

2 結 果

2.1 3組神經功能障礙評分 3組大鼠在入選時神經行為評分均小于 1分(P＞0.05)。按Bederson分級評定,術后各時間點治療組神經功能評分均較ICH對照組低(P＜0.05),而較假手術組明顯高(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組在不同時間點的神經功能障礙評分(±s)分

表1 各組在不同時間點的神經功能障礙評分(±s)分

組別 n 術前 術后6 h 術后24 h 術后48 h 術后3 d 術后7 d假手術組 36 0.87±0.69 0.89±0.68 0.76±0.57 0.89±0.40 1.06±0.32 0.46±0.39 ICH 對照組 36 0.69±0.53 3.63±1.06 4.44±1.12 4.75±1.31 5.50±1.44 3.88±1.25治療組 24 0.75±0.60 2.11±0.251)2) 2.69±0.371)2) 1.56±0.421)2)與假手術組比較,1)P＜0.05;與ICH對照組比較,2)P＜0.05

2.2 3組血腫周圍腦組織含水量變化 治療組血腫周圍含水量較ICH對照組降低(P＜0.05),而較假手術組明顯升高(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組不同時間點腦組織含水量(±s)%

表2 各組不同時間點腦組織含水量(±s)%

組別 n 術前 術后6 h 術后24 h 術后48 h 術后3 d 術后7 d假手術組 36 79.12±0.81 78.07±0.61 78.13±0.82 78.45±0.75 79.06±0.76 77.16±0.21 ICH 對照組 36 78.42±0.53 79.46±0.35 83.47±0.34 83.21±0.56 87.62±0.31 81.32±0.62治療組 24 79.62±0.95 79.86±0.541)2) 82.39±0.601)2) 79.47±0.911)2)與假手術組比較,1)P＜0.05;與ICH對照組比較,2)P＜0.05

2.3 病理改變 神經軸突呈綠色或藍綠色;神經髓鞘呈棗紅色或紫紅色;神經元的細胞漿呈藍綠色;細胞核呈紫藍色;紅細胞呈鮮紅色;血管的內彈力膜呈綠色;膠原纖維呈綠色。改良三色法顯示腦出血組6 h軸突有不規則增粗、斷端膨大呈球形、部分髓鞘與軸突之間的間隙增寬,腦出血3 d軸突不規則增粗、出現收縮球、髓鞘明顯彎曲、不完全地附著在軸突表面,甚至剝脫。腦出血7 d時病理變化不及3 d時明顯。而治療組48 h、3 d、7 d軸突增粗及髓鞘脫失均有明顯改善。

3 討 論

腦出血后血腫周圍也存在一個“半暗帶”,即組織損傷和水腫形成進行性加重的區域。首先血腫及其腦水腫的壓迫對腦組織造成機械性損害,隨后由于血腫本身演變,釋放凝血酶,膽紅素,Fe2+等毒性物質對周圍組織產生毒害作用,以及血腦屏障破壞進一步加重腦水腫,均可對缺血高度敏感和形態結構特殊的髓鞘和神經纖維造成損害,從而引起和加重神經功能障礙[7,8],因此腦水腫的產生和發展是導致患者神經功能惡化甚至死亡的主要原因。本研究結果顯示,術后各時間點治療組神經功能評分及腦組織周圍含水量均較ICH對照組低,而較假手術組明顯高。病理結果顯示治療組軸突增粗及髓鞘脫失均較腦出血組有明顯改善,提示法舒地爾的應用能夠減輕腦出血后神經纖維的損傷,改善神經功能,可能有一定的腦保護作用。

改良三色染色法目前是膠原纖維的主要染色方法之一[9],在神經纖維的染色中應用很少。本實驗采用此方法對腦出血后血腫周圍腦組織進行染色,觀察其結果能夠同時明確地顯示出軸突和髓鞘的病理變化情況,并且可見到嗜銀染色所顯示的神經軸突的病理改變,如軸突不規則增粗、斷端膨大、出現收縮球等。而且此方法染色時間短,結果顯示清晰、不易脫片。這表明改良三色法優于嗜銀染色[10]。說明此染色方法在神經纖維中值得應用及進一步研究。

[1]Bito H,Furuyashiki T,Ishihara H,et al.A critical role for a vhoassociated kinase,P160 ROCK,in determining ax on outgrowth in mammalian CNS neurons[J].Neuron,2000,26:431-441.

[2]Shinichi S,Tatsuma U,Kazuyuki T,et al.Phannaeo-logieal profile of hydroxyl fasudil as a selective rho kinase inhibitor on ischemic brain damage[J].Life Seiences,2001,69:1441-1453.

[3]Breitenlechner C,Gassel M,Hidaka H,et al.Protein kinase A in complex with Rho-klnase inhibitors Y-27632,Fasudil,and H-1152P:Structural basis of selectivity[J].Structure(Camb),2003,11(12):1595-1607.

[4]Satoh S,Toshima Y,Ilegaki I,et al.Wide therapeutic time windows for fasudil neurop rotection against ischemia-induced delayed neuronal death in gerbils[J].Brain Res,2007,1128(1):175-180.

[5]Bederson JB,Pitts LH,Tiles M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion:Evaluation of the model and development of a neurologic ex amination[J].Stroke,1986,17:472.

[6]鄧平,宋一璇,祝家鎮.改良三色法顯示石蠟切片中的神經軸突及神經髓鞘[J].中華病理學雜志,1998,27(3):235.

[7]Neumann H.Molecular mechanisms of axonal damage in inflammatory central nervous system diseases[J].Curr Opin Neurol,2003,16:267-273.

[8]Qing WG,Dong YQ,Ping T Q,et al.Brain edema after intracerebral hemorrhage in rats:The role of iron overload and aquaporin[J].Neurosurg,2009,110(3):462-468.

[9]陳敬文,鐘端陽,張偉.介紹一種改良的M asson氏三色染色法[J].中國組織化學與細胞化學雜志,2010,19(2):209-210.

[10]鄧平,祝家鎮,宋一璇.腦干損傷后神經元及軸突改變的組織化學觀察[J].法醫學雜志,2001,17(1):10-11.