脊髓小腦性共濟失調3型的臨床特征和基因診斷

王子峰，李連平，曲立貞，蘇 凈，李季春，曹 霞*

(1濟寧醫學院附屬高唐縣人民醫院，山東高唐252800;2濟南軍區總醫院)

脊髓小腦性共濟失調是一種以肢體運動協調障礙為主要特點的常染色體顯性遺傳疾病。基因學檢測是目前診斷遺傳性脊髓小腦性共濟失調(SCA)的金標準。近1年來，本研究對其臨床特征及基因診斷方面的特征進行了探討。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集臨床診斷為SCA家系20例，均為漢族，其中患者10例、家系內正常人10例。家系1:先證者(Ⅲ6)，男，38歲。該家系來自山東地區，家族無近親結婚史。4代17例成員中女性患者2例，男性患者4例，發病年齡25～36歲，符合常染色體顯性遺傳規律。先證者體征:構音不清，偶有飲水嗆咳，向右注視時可見慢眼動，向左注視時可見快速眼震。雙上肢近端肌肉、雙側胸鎖乳突肌明顯萎縮，雙上肢肌力Ⅴ級，雙下肢肌力Ⅳ級。可見肌肉束顫。四肢肌張力增高。指鼻試驗、雙手輪替運動均不穩準，右側重于左側。雙上肢肱二頭肌反射、肱三頭肌反射均活躍，雙下肢膝腱反射、跟腱反射均亢進。髕陣攣、踝陣攣均陽性。雙側Hoffmans征陽性，雙側Babinski’s征陽性，余病理征未引出。腦膜刺激征陰性。家系內其他部分患者可見眼球內陷、雙側快速眼震等體征。家系2:先證者(Ⅲ6)，女46歲，該家系來自山東地區，患者母親、舅舅、1個弟弟均有類似癥狀，4代14例成員中女性患者2例，男性患者2例，最高發病年齡52歲，最低發病年齡42歲，平均發病年齡46歲，符合常染色體顯性遺傳規律。先證者體征:神志清楚，言語清晰，顱神經檢查未發現異常，四肢肌力Ⅴ級，肌張力正常，閉目難立征(+)，T6以下痛覺減退，雙下肢末端觸覺減退，雙側膝關節以下振動覺減退，雙側腱反射對稱減弱，病理征未引出，頸軟，腦膜刺激征陰性。家系1遺傳家系圖:見圖1(使用中國遺傳咨詢網家系圖在線繪制工具繪制)。家系2遺傳家系圖:見圖2(使用中國遺傳咨詢網家系圖在線繪制工具繪制)。

圖1 家系1遺傳家系圖

圖2 家系2遺傳家系圖

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR反應 使用TaKaRa DNA提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司提供)提取患者靜脈血中DNA。SCA3亞型引物的PCR參照文獻。2%瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下觀察PCR擴增產物，發現2個家系SCA3引物PCR擴增均發現異常條帶，考慮為 SCA3亞型。使用 TaKaRa Agarose Gel DNA Purifiation Kit Ver.2.0瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(大連寶生物工程有限公司提供)回收DNA。

1.2.2 PCR產物克隆及測序 家系1先證者SCA3引物PCR產物電泳結果，可見400 bp大小異常條帶，回收此條帶DNA進行純化。將已純化PCR產物使用 TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2.0(Code No.D6022)中的SolutionⅠ直接和載體pMD18-T(Code No.D101A)連接，連接產物熱轉化至E.coli Competent Cell JM109中，涂布平板(LB液體培養基)，37℃過夜培養，觀察有無菌落。然后挑取不同白色單個菌落加入LB液體培養基中培養5 h以上，以此菌液為模板，使用M13-47/RV-M(M13-47堿基序列:CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC;RV-M堿基序列:GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG)引物進行PCR擴增，電泳檢測。并同時移板(LB液體培養基)，挑選陽性克隆子進行基因序列測定。將選定的含有陽性克隆的單菌落進行植菌，利用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV801A)提取質粒。在 ABI PRISM 3130XL型全自動DNA測序儀上使用RV-M引物對質粒測序。

2 結果

2.1 部分患者瓊脂糖凝膠電泳結果 家系1先證者及家系內其他患者，均可見一條約250 bp基因條帶和一條400 bp異常基因條帶。因等位基因一條來自父方，一條來自母方，家系1先證者為父系遺傳，因此250 bp基因條帶來自等位基因的母系基因，400 bp異常基因條帶來自等位基因的另一條父系異常基因。家系1正常人SCA3 PCR產物均可見約250 bp正常擴增條帶。先證者兒子PCR產物電泳結果，未見異常電泳條帶。家系2患者SCA3 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳均可見約400 bp異常條帶。家系2正常人SCA3 PCR產物凝膠電泳擴增條帶均可見約250 bp左右正常電泳條帶，未見異常基因擴增帶。

2.2 2個家系患者發病特點及部分測序結果 見表1。

3 討論

脊髓小腦性共濟失調3型是SCA中最為常見

表1 2個家系患者發病特點及部分測序結果

2.3 2個家系部分患者SCA3 PCR擴增產物基因測序 見圖1、圖2、圖3。的類型，在漢族人群的脊髓小腦性共濟失調中約占50%。SCA3的臨床表型具有高度的遺傳異質性和臨床變異性，根據目前研究，大致分為5種不同臨床亞型［2，3］，根據此種分型，家系 1 患者病情嚴重，發病年齡較早，主要表現為小腦體征，同時伴有嚴重的錐體系和錐體外系癥狀，部分患者可見突眼，屬于第1種亞型。家系2患者癥狀相對較輕，起病晚，伴有周圍神經病變為其特點，屬于第3種亞型。

關于SCA3亞型發病機制，研究表明系由突變的CAG重復堿基片段編碼含有多聚谷氨酰胺片段的蛋白所致病［4］。正常人與患者的主要區別表現在CAG重復數目的不同，正常人CAG重復數目一般為12～41次，患者62～84次。國內謝秋幼報道，SCA3患者CAG重復數目為67～85次。本研究中的2個SCA3家系患者CAG重復數目為51～67次，明顯低于謝秋幼等報道。且2個家系患者代間傳遞中有明顯的發病年齡提前趨勢，從表1可以看出家系1患者發病年齡第3代比第2代提前，癥狀有加重趨勢;家系2患者發病年齡第3代比第2代也明顯提前5歲左右，癥狀程度類似。家系1患者臨床癥狀在代間傳遞中有明顯的加重趨勢。在此表中還可看出，2個家系CAG重復序列數在第3代患者中比第2代明顯增多。這也提示臨床癥狀、發病年齡均與CAG重復數目有關，CAG重復次數越多發病年齡越小且癥狀越重［4］，進一步證明了此前提到的遺傳早現現象。遺傳早現現象主要在父系遺傳中更明顯。家系1先證者屬于父系遺傳，也說明了這一點。在家系2先證者屬于母系遺傳，家系2第3代患者中CAG重復序列數比第2代CAG序列數無明顯增多，雖發病年齡提前，但癥狀無加重，需進一步搜集病例分析母系遺傳中SCA3的表現。此外，家系1中Ⅲ1 CAG重復序列數為53次，Ⅲ6 CAG重復序列數為67次，但Ⅲ1患者發病年齡比Ⅲ6發病年齡提前9歲;家系2部分患者中CAG重復序列數多于家系1患者，但臨床癥狀卻較家系1患者輕，這種現象可能與遺傳異質性有關。由于不同患者具有不同的遺傳基礎，從而導致遺傳方式、病程進展、發病年齡、預后以及復發風險、病情嚴重程度等都可能不同。研究表明，遺傳異質性的存在是導致遺傳病病種增多的原因之一。

家系2中Ⅰ3、Ⅰ4生前均沒有共濟失調癥狀，死因也可排除SCA類疾病，但在子代中出現了發病患者。這是因為CAG重復片段所在的等位基因具有多態性的特點［5］，如果等位基因攜帶有處于正常與異常之間的CAG重復數目(即所謂帶有中間數目的CAG重復片段，國外報道SCA3一般為48～51次［6］)，由于CAG重復片段的不穩定性，在下一代中CAG重復易發生新的突變發病，尤其在父系遺傳中更明顯。因此推測家系2的Ⅰ3(男性，75歲時去世)可能攜帶有中間數目的CAG重復片段。

SCA3癥狀前患者，是指基因檢測CAG重復數目異常，尚無臨床癥狀的人。由于SCA3是一種遲發性神經變性疾病，因此癥狀前患者達到一定年齡必定會出現癥狀。在目前尚無有效治療方法的情況下，基因學檢查明確癥狀前診斷防止該病發生具有重要意義。在本實驗的家系1中，Ⅲ1屬于癥狀前患者，因為在留取血樣時，患者尚未出現臨床癥狀，經基因檢測CAG重復數目為53次，在隨訪2 a后患者出現共濟失調癥狀，且發病年齡較其父親提前，癥狀更重。這也證實了癥狀前基因診斷預測發病的準確性。癥狀前診斷的重要意義在于使SCA家系中正常人對于自己是否發病有準確的預測，使癥狀前患者在婚育年齡對下一代做到產前診斷，防止帶有異常基因的患兒出生。對于經基因診斷明確為SCA3或其他SCA亞型的患者，對家系內正常人均應留取血液進行基因學檢測，篩選家系內的癥狀前患者，一旦診斷CAG重復序列異常，即可診斷成立，其致病基因的外顯率為100%。

［1］段曉慧，顧衛紅，王國相.常染色體顯性遺傳脊髓小腦性共濟失調表型和基因型的相關性［J］.中日友好醫院學報，2008，22:41-43.

［2］殷鑫湞，張寶榮，吳鼎文，等.脊髓小腦性共濟失調第7型的臨床特征及基因突變研究［J］.遺傳，2007，29(6):688-692.

［3］Dürr A，Stevanin G，Cancel G，et al.Spinocerebellar ataxia 3 and Machado-Joseph disease:clinical，molecular，and neuropathological feature［J］.Ann Neurol，1996，39(4):490-499.

［4］Sakai T，Kawakami H.Machado-Joseph disease:a proposal of spastic paraplegic subtype［J］.Neurology，1996，46(3):846-847.

［5］Ikeda H，Yamaguchi M，Sugai S.Expanded polyglutamine in the Maehado-Joseph Disease protein induces cell death in vitro and in vivo［J］.Nat genet，1996，13(2):196-202.

［6］Viktor Honti，László Vécsei.Genetic and molecular aspects of spinocerebellar ataxias［J］.Neuropsychiatric Disease and Treatment，2005，1(2):125-133.