β防御素1基因-688G/C單核苷酸多態性與膿毒癥的相關性

吳水晶，沈寅華，丁恩平，謝美月，馬震俊，周 華

(浙江大學醫學院附屬第一醫院，杭州310003)

β防御素1(DEFB1)是最早發現的一種β防御素，它具有較強的廣譜抗菌活性，能夠殺死G+和G－菌、真菌、包膜病毒等多種病原微生物，并且可以趨化未成熟樹突狀細胞和記憶性T細胞到局部炎癥反應部位發揮效應，在固有免疫和獲得性免疫中發揮重要作用。本文通過對膿毒癥患者和對照者DEFB1基因啟動子區域－688G/C單核苷酸多態位點進行基因型分析，探討DEFB1基因啟動子區域－688G/C單核苷酸多態性與膿毒癥易感性和預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2005年1月～2007年8月我院ICU病房確診為膿毒癥患者211例(膿毒癥組)，男123例、女 88例，年齡(60.6±17.5)歲;死亡 110例，存活101例。膿毒癥診斷嚴格按照1992年和2001年美國胸科醫師學會和危重醫學會聯席會議制定的膿毒癥診斷標準，并排除孕婦及年齡小于18歲的患者。對照組為157例浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院同期擇期手術后未并發膿毒癥患者，男96例、女61例，年齡(58.4±18.3)歲。兩組性別、年齡有可比性。

1.2 方法 在獲得患者知情同意后，抽取外周靜脈血10 ml于EDTA抗凝管。每一個樣本移取200 μl用QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN公司)嚴格按照說明書提取樣本基因組 DNA。NCBI/Gene Bank網站獲得DEFB1基因全長序列，premier 5.0引物設計軟件設計PCR引物。引物序列如下:上游引物:5'-AGGTTAGGCAGTTCTGATGG-3';下游引物:5'-CCACTGAGACATCAGGAAAG-3'。引物擴增的PCR產物片段大小為547 bp，由上海生工生物技術工程技術服務公司合成。PCR反應體系為25 μl，包括:ddH2O 14.8 μl;10 × buffer 2.5 μl;dNTP(10 mmol/L)1.0 μl;上游引物(10 pmol/μl)1.0 μl;下游引物(10 pmol/μl)1.0 μl;MgCl2(25 mmol/L)2.5 μl;Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)0.2 μl;模板 DNA 2 μl。Mastercycler gradient PCR 儀(德國 Eppendorf公司)中進行擴增。擴增條件為:95℃ 3 min，95℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，共35 個循環。利用Cac8I(New England BioLabs公司)對PCR產物進行酶切。酶切后產物片段大小為384 bp和163 bp。酶切體系為 20 μl，包括:ddH2O 14.75 μl;PCR產物 3 μl;10 × buffer 2.0 μl，;Cac8I(4 U/μl)0.25 μl。20 μl的酶切產物，經 1.8%的瓊脂糖凝膠電泳和0.1%的溴化乙錠染色方法110 V電壓電泳42 min觀察分析DEFB1－688位點的基因型。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計學軟件，計數資料用百分比表示，組間基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗及Fisher's exact檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

膿毒癥組和對照組DEFB1基因啟動子區域－688位點基因型GG、GC、CC分布頻率及等位基因G、C的頻率比較均無統計學意義(P＞0.05)。膿毒癥中死亡組與存活組基因型GG、GC、CC分布頻率，等位基因G、C的頻率比較均無統計學意義(P＞0.05)。見表1、2。

表1 膿毒癥組和對照組DEFB1－688位點基因型和等位基因分布［例(%)］

表2 膿毒癥中死亡組和存活組DEFB1－688位點基因型和等位基因分布［例(%)］

3 討論

DEFB1基因在基因組中單拷貝，但存在多個單核苷酸多態位點(SNPs)，兒童HIV感染相關研究發現，DEFB1啟動子區域－44CC基因型與母親HIV感染以及胎兒感染 HIV 風險相關［1］;Milanese等［2］在對巴西東北人群中研究發現相似結果;Wallace等［3］研究表明，DEFB1 多態性(G→20A，C→44G，G→52A and Val38Ile)及其單倍型與吸煙患者肺部感染及其肺功能減退并無相關性;另外有研究表明，Val38Ile與日本人群患COPD相關，668C/G多態位點與中國人群COPD易感性相關［4］;本研究小組之前研究也發現，－44G/C單核苷酸多態性與重癥膿毒癥的易感性和預后存在相關性［5］。

本研究發現，DEFB1基因－688位點基因型分布和等位基因頻率在膿毒癥組和對照組以及膿毒癥組中死亡組和存活組之間均無顯著性差異，與膿毒癥的易感性和預后無相關性，與Sun等［6］研究結果存在差別。我們分析引起這種結果差異的原因可能有兩點:①DEFB1是一個腫瘤抑制因子，其高表達可以誘導腫瘤細胞發生凋亡，抑制腫瘤細胞的生長。因此，攜帶突變體等位基因C的人群由于其體內DEFB1水平相對低下，其患前列腺癌的風險相對增加。而DEFB1在膿毒癥中的作用較復雜，它不僅可以直接殺滅病原微生物，而且可以通過調節免疫細胞發揮效應。②報告基因技術只是將DEFB1基因單獨進行分析，并且Sun等［6］只是對轉錄起始點上游79～1 140 bp序列進行了研究。因此，DEFB1基因－688G/C多態位點相對比較獨立，受其他多態性位點的影響小。本研究是在整個基因組中對DEFB1基因－688位點多態性進行基因型分析，DEFB1基因－688位點可能和其鄰近位點的單核苷酸多態性存在連鎖不平衡，影響 －688位點對DEFB1表達的調節作用和DEFB1在固有免疫系統中的功能。

影響膿毒癥發生發展的因素很多。各種細胞因子水平影響膿毒癥的發生和進展，防御素和細胞因子間也存在著廣泛的聯系，防御素基因也與鄰近基因廣泛交互影響。因此，將來運用高通量、快捷、先進的基因分型技術分析多個基因、多個位點的基因型，利用病例—對照關聯分析和連鎖不平衡分析方法可能更有利于探索遺傳因素在膿毒癥以及其他多基因疾病中的作用。

［1］Dommisch H，Acil Y，Dunsche A，et al.Differential gene expression of human beta-defensins(hBD-1，-2，-3)in inflammatory gingival diseases［J］.Oral Microbiol Immunol，2005，20(3):186-190.

［2］Milanese M，Segat L，Pontillo A，et al.DEFB1 gene polymorphisms and increased risk of HIV-1 infection in Brazilian children［J］.AIDS，2006，20(12):1673-1675.

［3］Wallace AM，He JQ，Burkett KM，et al.Contribution of alpha-and beta-defensins to lung function decline and infection in smokers:an association study［J］.Respir Res，2006，7(1):76.

［4］Matsushita I，Hasegawa K，Nakata K，et al.Genetic variants of human beta-defensin-1 and chronic obstructive pulmonary disease［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，291(1):17-22.

［5］Chen QX，Lv C，Huang LX，et al.Genomic variations within DEFB1 are associated with the susceptibility to and the fatal outcome of severe sepsis in Chinese Han population［J］.Genes Immun，2007，8(5):439-443.

［6］Sun CQ，Arnold R，Fernandez-Golarz C，et al.Human beta-defensin-1，a potential chromosome 8p tumor suppressor:control of transcription and induction of apoptosis in renal cell carcinoma［J］.Cancer Res，2006，66(17):8542-8549.