慢性丙型肝炎患者IL-28B基因多態性檢測及臨床應用

王永忠，嚴 桐，朱 珍，葉春艷，周勝生，芮冬妹，申紅玉，柳龍根

(常州市第三人民醫院，江蘇常州213001)

聚乙二醇干擾素(PEG-IFN-α)聯合利巴韋林(RBV)是目前治療丙型肝炎病毒(HCV)感染的標準模式。最新研究表明，白細胞介素28B(IL-28B)基因多態性與PEG-IFN-α和RBV聯合治療效果具有較高的相關性［1～3］。我們對42例接受PEG-IFN-α和RBV聯合治療的慢性丙型肝炎患者IL-28B基因區rs12980275、rs12979860、rs8099917的多態性進行了檢測分析。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年1月～2011年3月我院收治的42例慢性丙型肝炎患者，均接受180 μg/周PEG-IFN-α聯合RBV治療，診斷及療效判斷標準參照2000年全國傳染病與寄生蟲病學會和肝病學分會聯合修訂的病毒性肝炎防治方案中的標準。其中，男24例、女18例，年齡18～73歲、平均42.5歲;有輸血史33例，吸毒史4例;基因型1b型39例，2a型1例，3b型2例。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針序列 IL-28B基因多態性檢測試劑盒由上海翼和應用生物技術有限公司提供。引物及探針序列見表1。

1.2.2 檢測方法 DNA提取采用血液基因組提取試劑盒(Qiagen公司)。PCR擴增體系包括10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，50 mmol/L KCl，2.0 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，300 nmol/L 引物，1.5 U 熱啟動 Taq酶，5 μl DNA 模板，總反應體積50 μl。反應條件:95 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72℃ 60 s，擴增35個循環;72℃延伸10 min。LDR反應體系包括20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)，10 mmol/L MgCl2，100 mmol/L KCl，10 mmol/L 二硫蘇糖醇，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L NAD+，12.5 nmol/L探針或引物，3 μl PCR產物，2 U DNA連接酶，總反應體積20 μl。反應條件:95 ℃ 2 min，95 ℃30 s，50℃ 4 min，循環35次。擴增完成后加入EDTA終止反應。取2.5 μl反應產物與等體積上樣緩沖液混合，然后94℃變性2 min，迅速在冰上冷卻后于ABI Prism 377測序儀上凝膠電泳30 min，采用Genemapper軟件進行分析。

表1 引物及探針序列

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件，基因多態性與病毒學應合采用Fisher精確檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-28B基因多態性頻率分布 42例患者rs12979860基因型均為CC型;rs12980275基因型，AA 型 39 例 (92.9%)，AG 型 3 例(7.1%);rs8099917基因型，TT型39例(92.9%)，TG 型3例(7.1%)。

2.2 IL-28B基因多態性與病毒學應答 42例患者中，快速應答(RVR，治療1個月HCV RNA低于檢測下限)34例，持續應答(SVR，治療6個月 HCV RNA低于檢測下限)41例，患者均獲得早期應答(EVR，治療3個月HCV RNA下降2個數量級以上)。不同基因多態性與PEG-IFN-α和RBV聯合治療的RVR率有關，與EVR和SVR無關。見表2。

表2 IL-28B基因多態性與病毒學應答［例(%)］

3 討論

研究發現，慢性丙型肝炎患者IL-28B基因區多態性與PEG-IFN-α聯合RBV治療效果具有較高的相關性。其中相關性最強的是rs12979860，主要表現為CC型、CT型或TT型，具有CC基因型的患者對標準治療法的SVR率是TT基因型患者的兩倍。不同人群攜帶等位基因C的概率不同，東亞人最高，歐洲人次之，非洲裔美國人最低［1］。Thomas等［2］認為，IL28-B基因多態性和種族分布有關，東亞人主要表現為CC基因型。本研究42例患者中，rs12979860全部表現為CC基因型，未發現其他基因型，表明在本地區rs12979860基因多態性的特征分布為CC型，不同于以往文獻報道［1～3］。患者均獲得EVR，41例患者獲得SVR，說明rs12979860基因CC型患者對PEG-IFN-α聯合RBV治療具有較高的病毒學應答。

Suppiah等［3］發現，多個核苷酸多態性和治療結果相關，其中聯系性最強的是位于IL-28B上游8 kb的一個 SNP-rs8099917，主要表現為 GG、GT或 TT型，且rs8099917基因GG型患者對標準療法的失敗率是GT或TT型患者的2倍。文獻還報道了IL-28B rs12980275、rs7248668和rs11881222多態性也和療效有關。42例患者中沒有檢測到rs8099917基因型GG，rs8099917基因型主要為TT型，與TG型相比表現出對PEG-IFN-α聯合RBV治療的PVR作用，但從SVR和EVR作用來看并沒有統計學差異，仍需擴大樣本量進一步分析。

綜上所述，IL-28B基因區rs12979860、rs8099917單核苷酸多態性檢測對PEG-IFN-α聯合RBV治療效果的預測具有一定的作用，值得臨床推廣應用。

［1］Ge D，Fellay J，Thompson AJ，et al.Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance［J］.Nature，2009，461(7262):399-401.

［2］Thomas DL，Thio CL，Martin MP，et al.Genetic variation in IL28B and spontaneous clearance of hepatitis C virus［J］.Nature，2009，461(7265):798-801.

［3］Suppiah V，Moldovan M，Ahlenstiel G，et al.IL28B is associated with response to chronic hepatitis C interferon-alpha and ribavirin therapy［J］.Nat Genet，2009，41(10):1100-1104.