紫杉醇對肝癌HepG2細胞增殖及凋亡的影響

吳裕文

(宜春市人民醫院，江西宜春336300)

紫杉醇是二萜類生物堿化合物，對多種惡性腫瘤具有較好的臨床療效。2010年6月～2011年6月，本研究觀察了紫杉醇對人肝癌HepG2細胞增殖及凋亡的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 紫杉醇由四川太極制藥有限公司提供，分子量為853.92，使用時用0.9%氯化鈉注射液稀釋至所需的藥物濃度。HepG2細胞由美國典型物種保藏中心提供。RPMI 1640培養基為Hyclone公司產品，小牛血清購自杭州四季青公司。MTT購自江蘇碧云天生物技術研究所。免疫組化試劑盒購自Santa cruz公司。HHCP-01 CO2培養箱，上海一恒科技有限公司生產。Bio-Rad550型酶標儀，美國生產。

1.2 方法

1.2.1 細胞傳代培養 人肝癌HepG2細胞接種于含10%滅活小牛血清的新鮮RPMI 1640培養液中，37℃、5%CO2培養箱中，2～3 d傳代1次。取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 細胞增殖活性的檢測 采用MTT法。取人肝癌HepG2細胞3×104個/ml，接種于96孔板內，200 μl/孔。每孔加入紫杉醇 20 μl，使終濃度分別為5、10、20 nmol/L為實驗組。每個濃度設3個平行孔，另設陰性對照組。37℃、5%CO2培養44 h，2 000 r/min離心 5min，棄上清，加無血清 RPMI 1640 培養液 200 μl及 5 mg/ml MTT 20 μl，繼續培養4 h后，平板離心機2 000 r/min離心5min，棄上清 160 μl，加入低滲鹽水 200 μl，同上離心洗滌 2 次后，棄上清 200 μl，加入無水乙醇 200 μl，反復吹吸幾次，待Fomanzan溶解后，在酶標儀570 nm處讀取OD值。

1.2.3 細胞形態學觀察 取人肝癌HepG2細胞1×104個/ml，接種于6孔培養板中，孔中預先放入蓋玻片，每孔2 ml，于37℃、5%CO2的培養箱中培養過夜后，將培養液吸出，分別加入終濃度為5、10、20 nmol/L紫杉醇，陰性對照組加入含終濃度為0.1%DMSO的培養基。以上各組作用48 h后，取出蓋玻片，PBS輕輕沖洗2次，4%多聚甲醛固定20min，晾干，加入 Hochest33342(4 μg/ml)，避光染色5min，用蒸餾水洗3次。熒光顯微鏡激發，觀察細胞形態。

1.2.4 DNA ladder條帶的觀察 取人肝癌HepG2細胞1×106/ml HepG2細胞分別接種于4個50 ml的培養瓶，1.5 ml/瓶，待細胞貼壁后，分別加入上述3個不同濃度的紫杉醇1.5 ml，對照組加入1.5 ml培養液，37 ℃、5%CO2培養 24 h，1 500 r/min離心7min，收集細胞，用PBS(pH 7.4)洗滌3次，最后1次移入1.5 ml的EP管中，加裂解液于70℃水浴振蕩15min，15 000 r/min 離心15min，重復2 次，取上清液500 μl加1 000 μl的無水乙醇使 DNA析出，15 000 r/min離心15min，最后用20 μl TE緩沖液(pH 7.4)溶解DNA。電泳前，用RNA酶(10 g/L)消化30min去除RNA。2%瓊脂糖凝膠電泳60min，紫外透射儀觀察并拍照。

1.2.5 細胞凋亡相關基因蛋白表達的檢測 采用免疫組化法。應用細胞爬片技術，按上述進行實驗分組，干預因素處理完畢后，冰丙酮固定5min，PBS浸泡3min，棄去，重復2次;滴加3%H2O2，室溫靜置5min，以去除內源性過氧化氫酶;PBS洗滌同前，滴加0.1%TritonX-100(打孔劑)20min;PBS洗滌同前;擦干組織周圍的PBS液，馬上滴加20 μl正常山羊血清封閉液，室溫10～15min，棄去，勿洗;用紙或紗布擦干組織周圍的血清，滴加20 μl一抗(1∶100兔抗鼠cFLIP抗體)，4℃過夜;洗滌同前;擦干組織周圍的PBS后加入相應的生物素化的二抗(1∶100生物素化山羊抗兔)20 μl，室溫靜置10～15min;洗滌同前;滴加20 μl HRP標記鏈霉卵白素，室溫靜置10～15min;洗滌同前;加20 μl DAB 顯色劑5～10min，鏡下觀察顯色情況，將顯色后的片子用自來水沖洗;復染，脫水，透明，封片。每張免疫組織化學片隨機10個視野，采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統，選用陽性單位(PU)指標定量表達免疫組織化學陽性反應。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件，數據以±s表示，計量資料的比較采用t檢驗。檢驗水準 α =0.05。

2 結果

2.1 不同濃度紫杉醇對人肝癌HepG2細胞增殖活性及凋亡相關基因蛋白表達的影響 紫杉醇3個濃度組細胞活性逐漸降低，且紫杉醇10、20 nmol/L組細胞活性明顯低于陰性對照組(P＜0.05或 ＜0.01)。與陰性對照組比較，不同濃度紫杉醇實驗組均能明顯抑制cFLIP、Survivin蛋白的表達，促進Caspase-3蛋白的表達(P＜0.05或 ＜0.01)。見表1。

表1 不同濃度紫杉醇對人肝癌細胞HepG2細胞cFLIP、Survivin、Caspase-3 蛋白表達的影響(n=3，±s)

表1 不同濃度紫杉醇對人肝癌細胞HepG2細胞cFLIP、Survivin、Caspase-3 蛋白表達的影響(n=3，±s)

注:與陰性對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

分組 細胞活性(OD)cFLIP(PU)Survivin(PU)Caspase-3(PU)0.61 ±0.07 54.8 ±1.09 56.1 ±1.11 22.6 ±1.03實驗組紫杉醇5 nmol/L 0.51 ±0.02 49.8 ±1.12 50.2 ±1.01 29.9 ±0.91紫杉醇10 nmol/L 0.49 ±0.05* 40.9 ±1.04* 41.8 ±1.01* 34.4 ±1.22*紫杉醇20 nmol/L 0.38±0.09＊＊ 21.3±0.99＊＊22.7 ±0.89＊＊ 51.2 ±1.15陰性對照組＊＊

2.2 細胞形態學的改變 熒光顯微鏡下，可見正常陰性對照組的細胞核完整，無明顯凋亡細胞;而20 nmol/L紫杉醇處理人肝癌HepG2細胞組可見部分細胞胞體縮小，胞質濃縮，核染色體高度凝聚、邊緣化，細胞核碎裂呈碎片狀，可見典型的新月形的凋亡小體。其他各濃度組改變不典型。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳的結果 陰性對照組HepG2細胞DNA靠近加樣孔附近可見完整的基因組DNA，而不同濃度的紫杉醇處理組發現了180～200 bp間距的凋亡細胞所特有的DNA ladder條帶。

3 討論

紫杉醇廣泛用于治療轉移的乳腺癌、卵巢癌和不適應手術的肺癌等腫瘤患者，導致有絲分裂阻滯和誘導細胞凋亡是其抗腫瘤的主要機制［1］。

細胞凋亡受凋亡促進因子和凋亡抑制因子的共同調節，盡管凋亡過程的詳細機制尚不完全清楚，但是已經確定Caspase在凋亡過程中起著必不可少的作用，是細胞凋亡的核心機制。其中Caspase-3是細胞凋亡過程中重要的效應分子，在細胞凋亡中起著不可替代的作用。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，也是迄今為止發現的、最強的凋亡抑制因子。cFLIP也是一種新發現的凋亡抑制因子，在多種腫瘤組織中表達增高［2］，對腫瘤的發生、發展起重要作用。cFLIP雖然有cFLIPL和cFLIPS 2種亞型，但Irmler等通過 Western分析發現，cFLIPL比cFLIPS具有更強的抑制Fas誘導凋亡的能力，在分別轉染了cFLIPS和cFLIPL的Jurkat細胞克隆中，cFLIPS的相對表達量高于cFLIPL，但只有cFLIPL表達克隆可避免可溶性FasL(sFasL)誘導的凋亡。因此，我們在實驗中只選擇了cFLIPL作為檢測指標。本研究表明，紫杉醇對人肝癌HepG2細胞的生長具有明顯的抑制作用，并具隨著藥物濃度的增加，細胞活性也在下降;同時紫杉醇能上調Caspase-3基因的表達，下調cFLIP和Survivin基因的表達，誘導HepG2細胞凋亡。

［1］張傳濤，史業輝，佟仲生.紫杉醇聯合腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體誘導MCF-7乳腺癌細胞系凋亡機制的研究［J］.中華乳腺病雜志，2008，2(6):27.

［2］蔣月，葛紅，葉柯，等.Survivin和Caspase-3在食管鱗癌術前放療前后的表達與預后關系分析［J］.中國腫瘤臨床與康復，2010，17(6):481-483.