VEGF-A對(duì)人肝癌細(xì)胞體外形成血管生成擬態(tài)能力的影響

李 蕊，孫保存，2*，孫 丹，劉鐵菊，趙秀蘭，董學(xué)易

(1天津醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，天津300070;2天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院)

肝癌是常見(jiàn)惡性腫瘤，因癌細(xì)胞血供豐富，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且治療困難，故肝癌病死率很高。腫瘤血供除來(lái)自內(nèi)皮依賴性血管外，血管生成擬態(tài)(VM)也是其來(lái)源之一。既往研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)與肝癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中存在 VM［1］。目前，關(guān)于VEGF-A對(duì)人肝癌細(xì)胞體外形成VM 能力的影響少見(jiàn)報(bào)道，2009～2011年，我們對(duì)此進(jìn)行了相關(guān)研究。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 人肝癌細(xì)胞系PLC/PRF/5由本研究室保存;兔抗人VE-cadherin多克隆抗體、β-actin兔抗人多克隆抗體、VEGF-A購(gòu)自美國(guó);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物公司。

1．2 檢測(cè)方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株，細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合時(shí)，以0．25%胰酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組及 VEGF-A 10、30、60、100 μg/L實(shí)驗(yàn)組。

1．2．2 細(xì)胞遷移檢測(cè) 將PLC細(xì)胞接種于12孔板，90%融合后，用無(wú)菌移液管尖對(duì)其表面進(jìn)行劃痕，PBS沖洗細(xì)胞后，更換含5%胎牛血清培養(yǎng)基，分別加入 VEGF-A 10、30、60、100 μg/L。隨機(jī)取 5個(gè)視野，在倒置顯微鏡(×100)下觀察PLC細(xì)胞從劃痕處向中央遷移的情況，分別于0、24、48 h測(cè)量劃痕距離。

1．2．3 明膠酶譜檢測(cè) 用不同濃度VEGF-A干預(yù)PLC細(xì)胞48 h后，收集上清液行明膠酶譜檢測(cè)。以含0．1%明膠的10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，至溴酚藍(lán)進(jìn)入陽(yáng)極緩沖液為止，用2．5%的 Trition-X100洗膠4次，每次30 min。將膠浸入明膠酶孵育液中，37℃孵育42 h，最后用考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色液脫色至藍(lán)色背景下可見(jiàn)清晰白色條帶，對(duì)降解帶密度、面積進(jìn)行測(cè)定，以降解條帶密度面積的乘積表示基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性。

1．2．4 三維培養(yǎng) 將1 cm×1 cm蓋玻片加入24孔板底壁，基質(zhì)膠與細(xì)胞培養(yǎng)基以1∶1比例混合后，取15 μl加入蓋玻片上，37℃、5%CO2溫箱放置1 h使其凝固，再加約含1×105個(gè)PLC細(xì)胞的完全培養(yǎng)液500 μl。實(shí)驗(yàn)組分別加入相應(yīng)濃度的 VEGF-A，將細(xì)胞置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化及管道形成情況。于倒置顯微鏡(×200)下隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)管道數(shù)量，取每個(gè)視野的均值，行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1．2．5 VE-cadherin檢測(cè) 采用 Western blot法檢測(cè)VE-cadherin，將融合90%以上的各組PLC細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解，分別提取其總蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳。將蛋白電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜后，分別加入VE-cadherin、β-actin，37℃孵育2 h;TBST漂洗后與山羊抗兔IgG抗體反應(yīng)，37℃孵育90 min;TBST漂洗，加入發(fā)光液后顯影、定影、拍照，用Image-J軟件進(jìn)行條帶灰度分析。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，相關(guān)分析用Pearson相關(guān)分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 VEGF-A對(duì)PLC細(xì)胞遷移的影響 誘導(dǎo)PLC細(xì)胞 24 h 后，VEGF-A 10、30、60、100 μg/L 組劃痕寬度分別為(0．576 ± 0．005)、(0．475 ± 0．012)、(0．451 ±0．007)、(0．397 ±0．002)mm，正常對(duì)照組為(0．695±0．011)mm。VEGF-A 組細(xì)胞遷移距離明顯高于正常對(duì)照組(P均＜0．01)，且隨VEGF-A濃度升高而逐漸增加，VEGF-A 10、30、60、100 μg/L組兩兩比較 P均 ＜0．05。48 h時(shí) VEGF-A 60、100 μg/L組劃痕損傷愈合。

2．2 VEGF-A對(duì) PLC細(xì)胞 MMP-2、MMP-9活性的影響 正常對(duì)照組及 VEGF-A 10、30、60、100 μg/L實(shí)驗(yàn)組的 MMP-2表達(dá)及活性增強(qiáng)均不明顯，其MMP-9表達(dá)分別為(88．674 ±9．798)、(118．792 ±10．354)、(128．563 ± 11．987)、(139．997 ±12．575)、(150．873 ±14．161)光密度;正常對(duì)照組與VEGF-A組、VEGF-A組間兩兩比較，P均＜0．05。

2．3 VEGF-A對(duì)PLC細(xì)胞形態(tài)變化及管道形成的影響 倒置顯微鏡下可見(jiàn)，4 h時(shí)VEGF-A各組PLC細(xì)胞呈圓形或卵圓形，部分細(xì)胞相互連接，有形成管道的趨勢(shì);9 h時(shí)細(xì)胞均形成明顯的管道樣結(jié)構(gòu)。而正常對(duì)照組均無(wú)上述改變。正常對(duì)照組及VEGFA 10、30、60、100 μg/L 實(shí)驗(yàn)組 PLC 細(xì)胞管道數(shù)量分別為(0．000 ±0．000)、(4．800 ±0．100)、(7．833 ±0．153)、(8．100 ± 0．265)、(13．167 ±0．513)個(gè)/視野，正常對(duì)照組與VEGF-A組、VEGF-A組間兩兩比較，P均＜0．05。相關(guān)分析顯示，VEGF-A濃度與管道數(shù)量之間呈顯著正相關(guān)(r=0．929，P ＜0．05)。

2．4 VEGF-A對(duì)PLC細(xì)胞VE-cadherin表達(dá)的影響見(jiàn)圖1。

圖1 VEGF-A對(duì)PLC細(xì)胞VE-cadherin表達(dá)的影響

3 討論

VM是1999年美國(guó)學(xué)者M(jìn)aniotis等［2］發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特的腫瘤血供方式，其特點(diǎn)為惡性腫瘤細(xì)胞在無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞參與下，通過(guò)自身塑形及與細(xì)胞外基質(zhì)作用形成的可為腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移提供血供的特有微循環(huán)管道，血液在此管道中流動(dòng)。該管道外周是一層由厚薄不一的PAS陽(yáng)性物質(zhì)構(gòu)成的基底膜，并與宿主血管相通，從而使腫瘤細(xì)胞獲得血供及營(yíng)養(yǎng)，以滿足其生長(zhǎng);由于構(gòu)成管壁的腫瘤細(xì)胞直接與血液接觸，使脫落的腫瘤細(xì)胞易經(jīng)過(guò)血循環(huán)流到其他部位發(fā)生轉(zhuǎn)移，故存在VM的腫瘤患者病情進(jìn)展迅速，轉(zhuǎn)移早，預(yù)后差。目前，在黑色素瘤、乳腺癌［3］、肝癌等腫瘤的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)VM現(xiàn)象。

VEGF是從牛垂體濾泡星狀細(xì)胞培養(yǎng)基中分離純化的肝素結(jié)合性生長(zhǎng)因子，由內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等合成，通過(guò)自分泌或旁分泌方式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGF受體，介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖和遷移，增加血管通透性，為新生的毛細(xì)血管提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)新生血管形成。VEGF-A是VEGF家族成員，是最重要的血管生成調(diào)節(jié)因子。大量研究顯示，VEGF高表達(dá)與腫瘤微血管密度、惡性程度及患者預(yù)后不良密切相關(guān)。

目前，關(guān)于VEGF對(duì)腫瘤VM形成的作用報(bào)道不一。Xu等［4］研究發(fā)現(xiàn)，在有、無(wú)VM的眼瞼皮脂腺腫瘤組織中VEGF表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示VM形成不依賴于VEGF。伍鋼等［5］通過(guò)轉(zhuǎn)染內(nèi)源性VEGF165到肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)，結(jié)果顯示VEGF165對(duì)HepG2細(xì)胞體外形成VM的能力無(wú)明顯影響。Wang等［6］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)VEGF-A干預(yù)后的卵巢癌細(xì)胞能在三維培養(yǎng)中形成典型的管道結(jié)構(gòu)。Mei等［7］通過(guò) siRNA沉默 VEGF基因證實(shí)，VEGF在骨肉瘤細(xì)胞形成VM過(guò)程中起重要作用，是VM形成的關(guān)鍵影響因素。

本研究顯示，不同濃度VEGF-A誘導(dǎo)肝癌PLC細(xì)胞后，其細(xì)胞體外侵襲、遷移和形成VM的能力均增強(qiáng)，且呈劑量依賴性;MMP-2在PLC細(xì)胞中的表達(dá)及其活性增強(qiáng)均不明顯，可能與在VEGF促進(jìn)肝癌PLC細(xì)胞形成VM過(guò)程中，MMP-9比MMP-2的作用重要有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，VEGF能通過(guò)自分泌方式促進(jìn)肝癌PLC細(xì)胞遷移、侵襲和VM形成，肝癌細(xì)胞模擬內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為圍成管道的可塑性是VM形成的分子基礎(chǔ)，MMP-2、MMP-9降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)為腫瘤細(xì)胞塑形、圍成管道、形成VM提供一定空間，是腫瘤細(xì)胞VM形成的前提條件。

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