重癥急性胰腺炎并腎損害大鼠腎組織Livin、Caspase-9蛋白變化及意義

劉 翼，祝 琳，周正端，張 巍，李昌平

(1瀘州醫學院附屬醫院，四川瀘州646000;2自貢市第四人民醫院)

目前，重癥急性胰腺炎(SAP)并腎損害的機制尚不完全清楚，研究認為可能與炎癥介質參與、微循環障礙、腎素—血管緊張素系統激活等有關［1］。Livin是新發現的凋亡抑制蛋白，半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)在誘導細胞凋亡的分子機制中起關鍵作用。為探討 SAP并腎損害大鼠腎組織 Livin、Caspase-9蛋白變化及意義，2010～2011年，我們進行了相關研究。現報告如下。

1 材料與方法

1．1 動物及試劑 雄性SD大鼠90只，體質量200～250 g，購自瀘州醫學院動物中心。褪黑素(MT)購自Sigma公司;兔抗大鼠Livin、Caspase-9多克隆抗體購自北京博奧森生物公司;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物公司。

1．2 方法

1．2．1 動物建模及分組 將90只大鼠隨機分為假手術組(A組)、SAP并腎損害組(SAP組)、MT干預組(MT組)各30只。術前12 h禁食、自由飲水。術時用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，打開腹腔，用4號靜脈針于十二指腸乳頭附近經十二指腸壁穿刺;逆行插入胰膽管，將5%牛磺膽酸鈉1 ml/kg逆行勻速推注至胰管后退針，確認腹腔無出血后關腹。A組開腹后僅翻動胰腺，恢復原狀后關腹。MT組術后10 min將MT液50 mg/kg注射于大鼠背部皮下。術后各組正常進食、飲水，6、12、24 h各處死10只。

1．2．2 血清學指標檢測 將各組處死大鼠開胸，心臟穿刺采血3～5 ml，室溫靜置30 min后離心20 min，收集血清置－20℃保存。用全自動生化分析儀檢測淀粉酶(AMY)、肌酐(Cr)，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD，硫代巴比妥法檢測MDA。

1．2．3 病理組織學檢測 將處死大鼠剖腹，取胰腺及腎組織用10%甲醛固定、石蠟切片、HE染色，在光鏡下觀察其病理改變。

1．2．4 Livin、Caspase-9 蛋白檢測 用免疫組化法檢測各組腎組織Livin、Caspase-9蛋白，胞質和(或)部分胞核內棕黃色著色為陽性。用Biosens Digatal Imaging Systerm進行圖像采集分析，每張圖片隨機選高倍鏡下5個有代表性的陽性區域進行平均灰度值測定，按文獻方法［2］將陽性面積和平均灰度值換算成陽性單位(PU)，PU值代表陽性表達水平。

1．2．5 統計學方法 采用SPSS14．0統計軟件，計量資料用±s表示，組間比較用單因素方差分析;檢測指標的相關性用多元線性回歸分析。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 胰腺、腎臟組織病理變化 A組各時間點胰腺、腎臟組織正常。SAP組6 h胰腺腺泡腫脹，小葉局灶性壞死;腎小球毛細血管淤血，炎細胞浸潤。12 h胰腺小葉片狀壞死，間質大量炎細胞浸潤;腎小管上皮細胞界限不清，管腔狹窄或閉鎖。24 h胰腺、部分腺葉正常結構消失;腎小管、腎小球囊內可見嗜伊紅染色的絮狀物和紅細胞。MT組6 h胰腺小葉間隙增寬，少量炎細胞浸潤;腎小管上皮細胞腫脹、間質水腫。12 h胰腺間質疏松、水腫，小葉局灶性壞死;腎小球毛細血管淤血，炎細胞浸潤增多。24 h胰腺腺泡出血、小葉片狀壞死;部分腎小管上皮細胞壞死。

2．2 各組血清AMY、Cr、MDA、SOD變化 見表1。

2．3 各組腎組織Livin、Caspase-9蛋白變化 見表2。

表1 各組血清 AMY、Cr、MDA、SOD 變化(±s)

表1 各組血清 AMY、Cr、MDA、SOD 變化(±s)

注:與 A 組比較，*P ＜0．01;與 SAP 組比較，#P ＜0．05，##P ＜0．01

組別 n AMY(U/L) Cr(μmol/L) MDA(nmol/L) SOD(U/L)A 組6 h 10 1 532．33 ± 287．18 25．34 ±1．07 6．12 ±0．12 96．23 ±6．65 12 h 10 1 623．56 ± 301．43 28．12 ±1．84 7．54 ±0．21 97．21 ±7．23 24 h 10 1 674．12 ± 313．52 30．42 ±1．92 7．76 ±0．53 97．53 ±8．04 SAP組6 h 10 2 314．24 ± 631．52* 72．12 ±2．02* 12．43 ±0．38* 76．78 ±4．91*12 h 10 3 268．58 ± 801．16* 84．57 ±2．38* 15．36 ±0．59* 63．92 ±3．25*24 h 10 5 862．87 ±1 134．43* 113．87 ±3．21* 17．89 ±0．67* 58．31 ±3．22*MT組6 h 10 1 785．61 ± 303．65## 37．24 ±1．06## 9．15 ±0．24# 98．11 ±5．45##12 h 10 1 924．11 ± 324．83## 48．57 ±2．61## 12．58 ±0．34# 84．26 ±5．01##24 h 10 3 453．25 ± 815．28## 65．87 ±3．37## 14．94 ±0．26# 72．76 ±4．21#

表2 各組腎組織Livin、Caspase-9蛋白變化(PU，±s)

表2 各組腎組織Livin、Caspase-9蛋白變化(PU，±s)

注:與 A 組比較，*P ＜0．01;與 SAP 組比較，#P ＜0．05，##P ＜0．01

組別 n Livin 6 h 12 h 24 h Caspase-9 6 h 12 h 24 h A 組 10 2．00 ±0．03 1．97 ±0．54 1．88 ±0．32 2．25 ±0．32 2．12 ±0．16 2．32 ±0．43 SAP 組 10 3．62 ±0．83* 3．38 ±0．71* 2．86 ±0．53* 6．43 ±1．28* 7．33 ±1．30* 8．21 ±1．65*MT 組 10 7．06 ±0．96## 5．86 ±1．28# 4．64 ±1．53# 4．65 ±0．87# 4．12 ±1．03# 3．89 ±0．87##

2．4 相關性分析 SAP組SOD與Cr、Caspase-9表 達呈負相關(r分別為 －0．810、－0．382，P均 ＜0．05)，MDA 與 Cr、Caspase-9 表達呈正相關(r分別為0．812、0．356，P 均 ＜ 0．05);SOD、MDA 與 Livin表達無相關性(P均＞0．05)。

3 討論

SAP是臨床危重癥，14% ～43%的患者并發腎損害，發展至急性腎衰患者的病死率達71% ～84%［3］。本研究顯示，SAP組隨造模時間延長，胰腺水腫、壞死、出血逐漸加重，間質炎細胞浸潤增多;腎臟充血、水腫、出血，腎小球、腎小管腫脹、壞死，后期見紅細胞及管型;其各時間點的AMY、Cr均高于A組。

有研究認為，SAP的發生、發展可能與體內脂質過氧化損傷密切相關。SOD能清除氧自由基，是機體抗氧化防御系統的重要成員;MDA是氧自由基導致脂質過氧化的終產物之一;兩者變化可反映體內脂質過氧化程度。本研究表明，隨SAP造模時間延長，SOD逐漸降低，MDA逐漸升高;且SOD與Cr呈負相關，MDA與Cr呈正相關，說明脂質過氧化可能參與腎損害。其可能機制是SAP時氧自由基形成增多，使脂質形成脂質過氧化物，脂質過氧化反應致胰腺組織損傷;大量SOD消耗使血中SOD下降，難以對抗脂質過氧化對胰外組織的損傷。

Caspase-9為凋亡始動子，能在其他蛋白參與下發生自我活化并激活下游的 Caspase。1993年，Crook等［4］首先在桿狀病毒CpGV、OPMNPV中發現并分離出凋亡抑制蛋白(IAPs)，其在腦、胸腺、腎、肝臟等組織高表達［5］。Livin屬于 IAPs家族新成員。本研究顯示，SAP組各時間點Livin、Caspases-9表達均高于A組，且隨時間延長，Livin、SOD逐漸降低，Caspases-9、MDA逐漸升高;SOD與Caspase-9表達均呈負相關，MDA與Caspase-9表達均呈正相關。說明Livin、Caspase-9表達可能與SAP并腎損害相關，脂質過氧化可能與其存在密切關系。

MT是具有強大抗氧化作用的吲哚類激素，可清除自由基，減輕急性炎癥反應［6］。本研究發現，與SAP組比較，MT組 AMY、Cr、MDA 下降，SOD 升高;Livin升高，Caspase-9降低。表明MT有抗氧化功能，并通過升高Livin、降低Caspase-9起到改善腎功能的作用。SAP組SOD、MDA與Livin表達均無相關性，提示脂質過氧化與Livin表達無關;但用MT干預后Livin下降，提示MT可能通過抗炎作用等途徑增強Livin表達，抑制凋亡作用。

總之，本研究顯示Livin、Caspase-9蛋白變化可能參與SAP大鼠的腎損害，外源性MT對SAP并腎損害有保護作用，其機制可能是通過抗脂質過氧化、提高Livin、降低Caspase-9表達實現的。

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［4］Crook NE，Clem RJ，Miller LK．An apoptosis-inhibiting baculovirus gene with a zinc finger-like motif［J］．J Virol，1993，67(4):2168-2174．

［5］Vucic D，Stennieke HR，Pisabarro MT，et al．ML-IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas［J］．Curr Biol，2000，10(21):1359-1366．

［6］Li JH，Yu JP，Yu HG，et al．Melatonin reduces inflammatory injury through inhibiting NF-kappa B activation in rats with colitis［J］．Mediators Inflamm，2005(4):185-193．