連翹三萜類化合物對前列腺癌PC-3細胞增殖抑制及放療敏感性的實驗研究

王彩蓮，殷海濤，劉寶瑞

(1東南大學附屬中大醫院，南京210009;2南京大學醫學院附屬鼓樓醫院)

前列腺癌(PC)多發生于老年，多數晚期患者對內分泌治療及放化療不敏感。三萜類化合物是近年從中藥連翹中分離的單體化合物，具有抗腫瘤活性。為探討連翹三萜類化合物達瑪-24-烯-3β-乙酰氧基-20s-醇(DM)對人PC-3細胞的增殖抑制及放療增敏作用，2009～2010年，我們進行了相關研究。現報告如下。

1 材料與方法

1．1 藥物、試劑與儀器 人PC-3細胞購自上海細胞生物所，連翹購自南京市同仁藥房。二甲基亞砜(DMSO，上海凌峰公司)，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物公司)，Roche端粒酶檢測試劑盒(上海吉泰生物公司)，流式細胞儀(美國)，西門子直線加速器(德國)。

1．2 方法

1．2．1 DM分離 連翹粉碎呈粉末狀，8倍量95%乙醇浸泡提取3次，乙醇提取物揮干得浸膏;用水、石油醚、乙酸乙酯分歩萃取法獲得連翹乙酸乙酯提取物，干燥后上硅膠柱，經石油醚、乙酸乙酯混合液分次洗脫，收集洗脫液，用旋轉蒸發儀旋干呈粉末狀;置真空干燥箱40℃過夜、保存。以50 mmol/L的濃度溶于DMSO液中。

1．2．2 細胞培養 PC-3細胞傳代、培養于含15%小牛血清的RPMI-1640培養液中，加入青霉素、鏈霉素各100 IU/ml，在37℃、5%CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1．2．3 細胞凋亡檢測 取 PC-3傳代細胞2 ml，以106個/ml密度接種于培養瓶中;細胞貼壁后，將DM液按終濃度 3．13、6．25、12．5、25．0、50．0 μg/ml分為5組，每組2 ml加入培養瓶中，每個濃度培養5瓶。24、48 h后，分別消化、收集經DM作用的細胞，離心、PBS洗滌各2次，4℃乙醇固定過夜。上機測定前離心去乙醇，用PBS洗滌1次;過濾后用PBS液懸浮細胞制成單細胞懸液，加人RNA酶、PI染色液;30 min后按Annexin V-FITC試劑盒說明書操作，用流式細胞儀檢測細胞周期，觀察細胞凋亡。

1．2．4 端粒酶活性檢測 將對數生長期PC-3細胞接種于6孔板中，每組接種9個復孔，每孔接種細胞6×104個。次日分別用含25 μg/ml的DM培養基(DM組)、普通培養基(對照組)替換6孔板的培養液，6、18、48 h后用端粒重復序列擴增法檢測PC-3細胞端粒酶活性。

1．2．5 細胞周期相關基因檢測 將對數生長期PC-3細胞接種于6孔板中，每組接種3個復孔，每孔接種細胞6×104個。分別用含25 μg/ml的DM培養基(DM組)、普通培養基(對照組)替換6孔板的培養液，18 h后收集細胞，用 Trizol法提取總RNA;用反轉錄酶AMV反轉錄mRNA為cDNA，測定cDNA濃度，稀釋為25 ng/μl。Real Time PCR循環參數為95℃預變性10 s，95℃變性5 s，60℃退火/延伸30 s，共45個循環。熔融曲線循環參數為95℃ 1 min，從55～95℃逐漸升溫，并記錄熒光信號。樣品均設3個復孔，以提取的總RNA為陰性對照。引物均為跨內含子設計，以免熒光定量PCR過程中可能存在的DNA污染對結果的干擾。PCR序列略。以β-actin作內參，藥物作用前細胞RNA作對照，參考文獻［1］計算藥物作用前后的腫瘤細胞周期相關基因 p21、Cyclin D1、CDC25A、TGF-β、Smad3 mRNA表達。

1．2．6 照射處理及集落形成實驗 用6 mV X線對貼壁后的細胞進行照射，分 0、1、2、3、4、6 Gy 6 個劑量，分單純和聯合放療。聯合組在放療同時按25 μg/ml終濃度加DM液2 ml，接種細胞數較單純組多，且隨照射劑量增加而增多。48 h后用PBS洗滌除去DM液，培養10～14 d后終止培養。棄去培養基，用PBS浸洗2次，純甲醇固定15 min。棄去固定液，加適量Gimsa應用液染色20 min;然后流水緩慢洗去染色液，空氣干燥后在顯微鏡下計數＞50個細胞數的克隆數，以0 Gy集落形成率作為對照組，計算各劑量組的細胞存活分數;用Sigmaplot統計軟件計算細胞存活曲線的D0、N、Dq值。

1．3 統計學方法 采用SPSS11．5統計軟件，計量資料用±s表示，組間均數比較用方差分析。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 不同時間、DM濃度誘導PC-3細胞凋亡率比較 見表1。

表1 不同時間、DM濃度誘導PC-3細胞凋亡率比較(%，±s)

表1 不同時間、DM濃度誘導PC-3細胞凋亡率比較(%，±s)

注:與 3．13 μg/ml比較，*P ＜0．05;與 6．25 μg/ml比較，△P ＜0．05

時間DM濃度(μg/ml)3．13 6．25 12．5 25．0 50．0 24 h 8．57 ±0．83 10．05 ±0．42 9．95 ±0．62 10．14 ±0．52 10．27 ±1．33 48 h 14．37 ±2．52 28．07 ±3．06* 45．88 ±4．93＊△ 48．38 ±3．73＊△ 52．34 ±5．50＊△

2．2 DM對PC-3細胞周期的阻滯作用 DM可引起PC-3細胞周期重新分布，增加G1期細胞比例，減少S期細胞比例，且隨著作用時間延長和濃度增加，這種趨勢更加明顯。

2．3 兩組不同時間PC-3細胞端粒酶活性比較 見表2。

表2 兩組不同時間PC-3細胞端粒酶活性比較(±s)

表2 兩組不同時間PC-3細胞端粒酶活性比較(±s)

組別6 h 18 h 48 h對照組1．37 ±0．02 1．42 ±0．05 1．79 ±0．04 DM 組 1．16 ±0．04 1．17 ±0．03 1．83 ±0．03 P ＜0．05 ＜0．05 ＞0．05

2．4 兩組細胞周期相關基因mRNA表達比較 見表3。

表3 兩組細胞周期相關基因mRNA表達比較(CT，±s)

表3 兩組細胞周期相關基因mRNA表達比較(CT，±s)

組別 p21 Cyclin D1 CDC25A TGF-βSmad3對照組 0．38 ±0．09 0．58 ±0．17 0．72 ±0．18 0．43 ±0．12 0．45 ±0．19 DM 組 0．65 ±0．13 0．36 ±0．11 0．47 ±0．22 0．61 ±0．14 0．62 ±0．25 P ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05

2．5 兩組不同放療劑量的PC-3細胞存活率比較見表 4。單純組 D0 值 3．486、N 值 1．523、Dq 值1．466，聯合組分別為 2．946、1．318、0．813;兩組放射增敏比(單純組Dq與聯合組Dq比)為1．80。

表4 兩組不同放療劑量的PC-3細胞存活率比較(%，±s)

表4 兩組不同放療劑量的PC-3細胞存活率比較(%，±s)

組別0 Gy 1 Gy 2 Gy 3 Gy 4 Gy 6 Gy單純組 96．48 ±2．17 87．25 ±3．22 76．84 ±2．26 54．48 ±1．99 41．27 ±2．37 29．34 ±1．65聯合組 94．36 ±3．21 79．59 ±2．34 64．65 ±3．07 43．47 ±4．15 31．39 ±2．63 18．87 ±1．70 P ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05

3 討論

目前，多數對連翹單體化合物功能的研究在其抗炎、抗病毒方面［2］，部分研究發現，連翹提取物有較好的抗腫瘤活性［3］。2010年，我們首次從連翹中分離提取了DM，并發現其與紫杉醇、多西紫杉醇有明顯協同效應［4］。三萜類化合物大部分由30個碳原子組成，可游離或以糖苷的形式存在，與糖結合的糖苷稱為三萜皂苷。人參、甘草、三七、遠志等中藥中含有三萜類成分。三萜類化合物主要分為四環三萜、五環三萜，四環三萜的常見抗腫瘤機制為細胞毒作用、細胞周期阻滯、信號通路調控、逆轉多藥耐藥、促進細胞分化和抑制腫瘤細胞轉移等［5，6］。

本研究發現，DM 6．25 ～50．0 μg/ml能抑制PC-3細胞增殖，其隨藥物濃度增加和作用時間延長而增強，有明顯的時效和量效關系。端粒酶是特殊的反轉錄酶，由RNA和蛋白質亞單位組成，能以自身RNA模板合成端粒DNA添加到染色體末端，避免染色體復制丟失端粒DNA使端粒延長，從而延長細胞壽命。我們發現DM作用PC-3細胞6 h后，腫瘤細胞端粒酶活性降低，48 h后其活性漸恢復至正常。提示DM有抑制腫瘤細胞增殖的作用。

細胞周期紊亂及細胞周期調控因子分泌失衡是腫瘤細胞的典型特征。Cyclin D1是周期相關蛋白基因，其編碼蛋白質可促進細胞增殖。p21基因編碼的p21蛋白可抑制細胞增殖。CDC25A是癌基因，其過度表達可致細胞生長失控后惡性轉化［7］。TGF-β介導的信號轉導可促進靶蛋白泛素化，Smad3是此過程的限速因子。本研究表明，DM可使細胞周期相關基因p21、TGF-β、Smad3表達增加，Cyclin D1、CDC25A表達降低;提示DM可上調凋亡基因，抑制抗凋亡基因表達，誘導腫瘤細胞凋亡，具有對腫瘤細胞多部位、多靶點調控的特點，可能成為新的抗腫瘤中藥的理想候選藥物之一。

本研究發現，DM液25 μg/ml有較高的細胞凋亡率，故用該濃度作為放療增敏濃度;結果顯示，聯合組用25 μg/ml DM液后，其放療增敏作用提高，細胞存活下降，提示DM液對PC-3細胞具有放療增敏作用。

［1］Livak KJ，Schmittgen TD．Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))method［J］．Methods，2001，25(4):402-408．

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［4］禹立霞，謝麗，魏嘉，等．6種中藥提取物對胃癌細胞株細胞毒作用及多西紫杉醇增敏作用的研究［J］．醫學研究生學報，2010，23(9):962-966．

［5］Choi S，Kim TW，Singh SV．Ginsenoside Rh2-mediated G1phase cell cycle arrest in human breast cancer cells is caused by p15 Ink4B and p27 Kip1-dependent Inhibition of cyclin-dependent kinases［J］．Pharm Res，2009，26(10):2280-2288．

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