加味涼膈散對脂多糖誘發小鼠血小板減少癥的影響

王 兵，王勇強，邵 蕾，曹書華

(天津市第一中心醫院，天津300192)

近年研究表明，細菌脂多糖(LPS)通過Toll樣受體4(TLR4)觸發宿主自身免疫，激活血小板使其大量破壞，是膿毒癥相關血小板減少的主要原因［1，2］。2008 年10月 ～2009年1月，為探討加味涼膈散對LPS誘發小鼠血小板減少癥的影響及其機制，我們進行了相關研究。現報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 健康雄性清潔級小鼠，8～10周齡，體質量(25±2)g，由中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心提供。大腸桿菌LPS(Sigma)，ELISA試劑盒(ADL)，酶標儀(奧地利)，血細胞分析儀(日本)。加味涼膈散顆粒由江陰天江藥業公司提供，由連翹、梔子、黃芩、淡竹葉、芒硝、玄參、丹參、麥冬、西洋參、大黃、薄荷、甘草組成。

1．2 方法

1．2．1 模型制備 將176只小鼠隨機分為8組，對照組8只用生理鹽水(NS)0．2 ml/(10 g·d)灌胃3 d后，經尾靜脈注射NS 100 μl/10 g，繼用NS灌胃3 d。模型組24只用NS灌胃3 d后，參照文獻［3］方法經尾靜脈注射LPS 8 mg/kg，制備內毒素血癥模型，繼用NS灌胃3 d。低劑量、中劑量、高劑量防治組各24 只，分別以加味涼膈散 0．94、1．89、2．84 g/ml灌胃3 d，然后經尾靜脈注射LPS 8 mg/kg，再用相應劑量加味涼膈散灌胃3 d。低劑量、中劑量、高劑量治療組各24只，分別于尾靜脈注射LPS 8 mg/kg，然后用相應劑量加味涼膈散灌胃3 d。除對照組外，其余各組于尾靜脈注射LPS后分別分為6、48、72 h三組。

1．2．2 標本采集及觀察指標檢測 摘除各組眼球取血1 ml，采用血細胞分析儀檢測其血小板計數(PCL);ELISA法檢測血漿巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和可溶性CD40配體(sCD40L);流式細胞儀檢測血小板TLR4表達。

1．2．3 統計學方法 采用SPSS11．5統計軟件，計量資料用±s表示，組間比較用單因素方差分析。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 各組不同時間的PCL變化 見表1。

2．2 各組不同時間的血漿sCD40L變化 見表2。

2．3 各組不同時間的血漿M-CSF變化 見表3。

2．4 各組不同時間的血小板TLR4表達變化 見表4。

3 討論

感染誘發的血小板減少癥是膿毒癥患者死亡的獨立風險因素［3］，Toll樣受體作為識別細菌共有成分的“模式”識別受體，主要在識別細菌后誘導免疫細胞內炎癥介質過度生成，是引發膿毒癥的關鍵因素［4］。在膿毒癥中，血小板是聯系凝血和炎性反應的關鍵物質，其表面有多種黏附分子和受體表達。前期研究表明，血小板可表達功能性TLR4，LPS可通過血小板表面TLR4誘導血小板活化，引起血小板減少［2，5］。Cognasse 等發現，LPS 對血小板免疫調節因子釋放的調控效力是血小板TLR4介導的。循環中95%以上的sCD40L來源于血小板，是體內血小板活化的血漿標記物。Francois等［6］研究證實，膿毒癥患者不明原因的血小板減少癥與吞噬血細胞作用和M-CSF升高有關。

表1 各組不同時間的PCL變化(×109/L，±s)

表1 各組不同時間的PCL變化(×109/L，±s)

注:與對照組比較，*P＜0．05;與模型組比較，#P＜0．05;與低劑量治療組比較，△P＜0．05;與中劑量治療組比較，☆P＜0．05;與高劑量治療組比較，▲P ＜0．05;與低劑量防治組比較，★P ＜0．05

組別 n 6 h 48 h 72 h對照組8 1 013．10 ±136．60模型組 24 298．30 ± 79．80* 654．40 ±106．50* 771．50 ±129．30*低劑量治療組 24 439．28 ± 88．30*# 722．31 ± 88．22* 911．35 ±111．67#中劑量治療組 24 397．76 ±101．61*# 757．05 ± 93．67* 952．13 ±104．02#高劑量治療組 24 357．98± 79．47* 576．66± 86．85＊△☆ 879．16±106．75*低劑量防治組 24 629．59±105．62*#△☆▲ 873．78±112．57*#△☆▲ 964．40± 97．01#中劑量防治組 24 747．32± 96．16*#△☆▲★ 822．98± 99．16*#▲ 942．75±101．04#高劑量防治組 24 691．31±103．65*#☆▲ 731．35± 77．34＊▲★ 989．42±124．17#

表2 各組不同時間的血漿sCD40L變化(ng/ml，±s)

表2 各組不同時間的血漿sCD40L變化(ng/ml，±s)

注:與對照組比較，*P＜0．05;與模型組比較，#P＜0．05;與低劑量治療組比較，△P＜0．05;與中劑量治療組比較，☆P＜0．05;與高劑量治療組比較，▲P ＜0．05;與低劑量防治組比較，★P ＜0．05

?

表3 各組不同時間的血漿M-CSF變化(pg/ml，±s)

表3 各組不同時間的血漿M-CSF變化(pg/ml，±s)

注:與對照組比較，*P＜0．05;與模型組比較，#P＜0．05;與低劑量治療組比較，△P＜0．05;與中劑量治療組比較，☆P＜0．05;與高劑量治療組比較，▲P ＜0．05;與低劑量防治組比較，★P ＜0．05

組別 n 6 h 48 h 72 h對照組8 179．35 ±15．74模型組 24 394．62 ±27．53* 337．78 ±31．02* 289．63 ±23．66*低劑量治療組 24 340．50 ±34．51*# 293．13 ±29．47*# 288．52 ±21．74*中劑量治療組 24 320．55 ±26．28*# 296．93 ±26．65*# 262．91 ±23．68*#高劑量治療組 24 363．21±35．27*#☆ 303．69±24．49*# 280．17±29．71*低劑量防治組 24 298．83±34．50*#△▲ 291．92±24．71*# 252．41±36．10*#△▲中劑量防治組 24 265．22±22．07*#△☆▲★ 279．33±28．92*# 265．33±27．68*高劑量防治組 24 268．97±27．74*#△☆▲★ 245．15±25．18*#△☆▲★ 239．93±23．56*#△▲

表4 各組不同時間的血小板TLR4表達變化(%，±s)

表4 各組不同時間的血小板TLR4表達變化(%，±s)

注:與對照組比較，*P＜0．05;與模型組比較，#P＜0．05;與高劑量治療組比較，▲P ＜0．05

組別 n 6 h 48 h 72 h對照組8 45．76 ±2．40模型組 24 50．37 ±3．20* 48．98 ±1．77* 46．71 ±2．74低劑量治療組 24 48．84 ±2．79* 48．37 ±2．59 47．06 ±2．70中劑量治療組 24 47．81 ±2．68 47．37 ±2．75 46．82 ±2．34高劑量治療組 24 49．66 ±3．51* 49．95 ±2．87* 46．29 ±2．97低劑量防治組 24 47．91 ±2．53 46．93 ±2．63▲ 45．75 ±2．49中劑量防治組 24 47．74 ±3．03 47．36 ±2．81▲ 46．14 ±2．88高劑量防治組 24 46．85 ±2．42#▲ 46．48 ±2．74▲45．38 ±2．02

本研究顯示，小鼠尾靜脈注射 LPS后6 h其PCL下降近70%，血小板TLR4表達明顯增加，血漿M-CSF、sCD40L明顯升高;提示內毒素血癥時血小板表達TLR4上調，并隨著以M-CSF升高為特征的巨噬細胞過度活化及以sCD40L升高為特征的血小板活化，使血漿M-CSF升高;一方面上調血小板表達TLR4，增強其識別并結合其配體LPS的能力，可增進血小板活化、釋放及參與炎癥反應的功能;另一方面M-CSF升高伴發的吞噬血細胞作用可使血小板壽命縮短，兩種過程都可增加血小板的消耗，使循環中的PCL進一步減少。

內毒素血癥動物模型的病機特點是毒邪內蘊、絡脈瘀滯、正氣頻衰，毒、熱、瘀在其發病過程中相互搏結。本研究以解毒清熱名方涼膈散(載宋《和劑局方》)為基本方加味，方中連翹清熱解毒、透散上焦之熱;配黃芩以清胸膈郁熱，梔子通瀉三焦、引火下行，大黃、芒硝瀉火通便，蕩滌中焦燥熱內結;薄荷、竹葉輕清疏散，解熱于上。根據“先證而治，截斷病勢”的治則，加用玄參、丹參以涼血滋陰、化瘀解毒;并在此基礎上加用西洋參補肺降火、生津液，以防熱盛而傷氣陰。全方清上與瀉下并行(瀉下為清瀉胸膈郁熱而設)，體現“以瀉代清”和給邪以出路，同時兼顧熱盛傷正，體現祛邪而不忘扶正，全方以攻逐毒邪為主，兼顧化瘀通絡扶正。

本研究顯示，與模型組比較，加味涼膈散防治組PCL升高，M-CSF、sCD40L、TLR4 降低;且隨劑量增加，其作用增強。表明加味涼膈散可能通過拮抗LPS與血小板TLR4結合，抑制血小板TLR4表達上調，減少血小板及巨噬細胞過度活化，從而緩解LSP誘發的M-CSF減少。

［1］Levi M，Lowenberg EC．Thrombocytopenia in critically ill patients［J］．Seminars in Thrombosis ＆ Hemostasis，2008，34(5):417-424．

［2］Aslam R，Speck ER，Kim M，et al．Platelet Toll-like receptor expression modulates lipopolysaccharide-induced thrombocytopenia and tumor necrosis factor-alpha production in vivo［J］．Blood，2006，107(2):637-641．

［3］Suzuki T，Takahashi T．Tissue-specific gene expression of hemeoxygenase-1(HO-1)and non-specific delta-aminolevulinate synthase(ALAS-N)in a rat model of septic multiple organ dysfunction syndrome［J］．Biochem Pharmacol，2000，60(2):275-283．

［4］Harter L，Mica L，Stocker R，et al．Increased expression of toll-like receptor-2 and-4 on leukocytes from patients with sepsis［J］．Shock，2004，22(5):403-409．

［5］Cognasse F，Hamzeh H，Chavarin P．Evidence of Toll-like receptor molecules on human platelets［J］．Immunol Cell Bio，2005，83(2):196-198．

［6］Francois B，Trimoreau F，Vignon P，et al．Thrombocytopenia in the sepsis syndrome:role of hemopha-gocytosis and macrophage colony stimulating factor［J］．Am J Med，1997，103(2):114-120．