高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)eNOS脫偶聯(lián)損害冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能

王 瑩，何立蕓，毛節(jié)明，王 廣*

(1北京市海淀醫(yī)院，北京100080;2北京大學(xué)第三醫(yī)院)

高同型半胱氨酸血癥(HHcy)是冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］，其可以通過損害血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)炎癥、氧化應(yīng)激等機(jī)制導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，Hcy可以通過降低血管內(nèi)皮細(xì)胞四氫生物蝶呤(BH4)的生物利用度而引起內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)脫偶聯(lián)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激及一氧化氮(NO)產(chǎn)生減少［3］。Coppola 等［4］給予 2型糖尿病患者蛋氨酸負(fù)荷造成急性HHcy后發(fā)現(xiàn)，患者冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能顯著降低。然而，慢性HHcy是否對(duì)患者冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能有影響以及可能的機(jī)制尚不十分清楚。在本研究中，我們探討慢性HHcy是否通過降低BH4的水平，引起eNOS的脫偶聯(lián)，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能的紊亂。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2008年9月～2009年5月，本研究采用病例對(duì)照的設(shè)計(jì)，入選病例均檢測(cè)空腹Hcy濃度，以高于15 μmol/L為標(biāo)準(zhǔn)分為兩組:健康對(duì)照組50例，其中男33例、女 17例，年齡(55.12±12.71)歲;HHcy組21例，其中男15例、女6例，年齡(52.90±13.23)歲。兩組患者均排除急性心肌梗死、冠狀動(dòng)脈疾病(冠狀動(dòng)脈造影顯示＞50%狹窄)、心力衰竭、肝腎功能異常、癌癥、感染性疾病、服用硝酸鹽類及B族維生素類藥物影響指標(biāo)測(cè)定等。

1.2 方法

1.2.1 血漿 BH4水平測(cè)定 取400 μl血漿置于EP 管中，加入100 μl 1 mol/L 三氯乙酸(TCA)，4 ℃20 000 g離心15min后，各取170 μl上清液轉(zhuǎn)移到2個(gè)新的EP管中，分別進(jìn)行酸、堿氧化。酸氧化過程:每 170 μl上清液中加入 25 μl酸性碘液(0.5%iodine、1%KI溶于 0.2 mol/L TCA 中)混勻后，室溫避光靜置60min，而后加入10 μl 1%新鮮配制的抗壞血酸，4 ℃ 20 000 g離心10min，取上清170 μl用于測(cè)定總的蝶呤水平(BH4+BH2+生物蝶呤);堿氧化過程:每 170 μl上清液中加入 10 μl 6 mol/L NaOH 和 25 μl堿性碘液(0.5%iodine、1%KI溶于0.2 mol/L NaOH中)，室溫避光靜置60min，而后加入10 μl 6 mol/L HCl及 10 μl 1%新鮮配制的抗壞血酸，4℃ 20 000 g離心10min，取上清170 μl用于測(cè)定BH2和生物蝶呤的水平。經(jīng)酸堿氧化處理后，即刻利用高效液相色譜儀器進(jìn)行測(cè)定，條件為:流動(dòng)相:甲醇/水 =5/95;流速:1.0 ml/min;柱溫:25 ℃;激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為350、440 nm，生物蝶呤出峰時(shí)間大約為8min，各實(shí)驗(yàn)組的測(cè)定含量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得，BH4的含量由酸堿氧化差值得出。

1.2.2 冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能檢測(cè) 冠脈血流速度儲(chǔ)備(CFVR)在一定程度上反映冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能，由經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖血流顯像技術(shù)檢測(cè)。在冠脈血流顯像模式下記錄靜息狀態(tài)及最大充血狀態(tài)下［應(yīng)用腺苷0.14 mg/(kg·min)］左前降支血流速度峰值，計(jì)算充血狀態(tài)及靜息狀態(tài)血流速度峰值比值，即為CFVR。

1.2.3 血漿NO水平的檢測(cè) 采用硝酸還原酶法測(cè)定患者血漿NO含量，具體操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行(北京四正柏生物科技有限公司)。

1.2.4 血漿生化指標(biāo)檢測(cè) 患者血漿總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、血糖、Hcy水平等指標(biāo)，由醫(yī)院檢驗(yàn)科測(cè)定。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，計(jì)數(shù)資料采用兩組頻數(shù)的χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Hcy、BH4、NO 及 CFVR 表達(dá) 見表1。

表1 兩組研究對(duì)象血漿Hcy、BH4、NO及 CFVR 水平(±s)

表1 兩組研究對(duì)象血漿Hcy、BH4、NO及 CFVR 水平(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05

CFVR對(duì)照組組別 Hcy(μmol/L)BH4(pmol/ml)NO(μmol/L)11.3 ±2.2 1.73 ±0.52 119.5 ±36.7 3.09 ±0.50 HHcy組 23.2 ±10.1* 1.43 ±0.41* 99.6 ±32.2* 2.76 ±0.50*

2.2 相關(guān)性分析 所有患者中，以血漿NO為應(yīng)變量，以Hcy為自變量，結(jié)果顯示血漿NO濃度與Hcy呈負(fù)相關(guān)性(r= －0.28，P ＜0.05);以 CFVR 為應(yīng)變量，以Hcy為自變量，結(jié)果顯示CFVR與Hcy呈顯著負(fù)相關(guān)性(r= －0.34，P ＜0.05)。

3 討論

HHcy是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，慢性HHcy患者冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能明顯受損，同時(shí)伴有血漿BH4和NO水平的降低;患者血漿BH4和NO水平呈顯著正相關(guān)性;此外，血漿Hcy水平與NO、CFVR分別呈顯著負(fù)相關(guān)性。從而提示慢性HHcy可能通過降低BH4生物利用度引起eNOS的脫偶聯(lián)，導(dǎo)致NO產(chǎn)生減少及冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能紊亂。

血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO對(duì)維持血管穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用，如維持血管張力、抑制血小板的聚集、白細(xì)胞的遷移以及黏附、抑制炎癥反應(yīng)和平滑肌細(xì)胞的增殖等。因而，NO的生物學(xué)活性降低是內(nèi)皮功能不全的標(biāo)志性事件［5］。NO是由eNOS催化底物精氨酸轉(zhuǎn)為瓜氨酸而產(chǎn)生，此過程需要輔助因子BH4的參與。當(dāng)BH4減少或缺乏時(shí)，eNOS產(chǎn)生的NO減少，而ROS產(chǎn)生增加，此過程稱之為eNOS的脫偶聯(lián)。我們的研究也發(fā)現(xiàn)患者血漿NO和BH4水平是呈正相關(guān)性的，從而提示BH4在NO產(chǎn)生途徑中起著重要作用。

一系列的研究表明，HHcy可以通過增加氧化應(yīng)激、降低NO生物利用度引起血管內(nèi)皮功能的紊亂。Hcy可以通過降低血管內(nèi)皮細(xì)胞BH4的生物利用度而引起eNOS脫偶聯(lián)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激及NO產(chǎn)生減少［3］。Hcy降低內(nèi)皮依賴的血管舒張功能并能增加內(nèi)皮細(xì)胞超氧陰離子的產(chǎn)生，而給予BH4預(yù)處理后，內(nèi)皮依賴的血管舒張功能得到改善的同時(shí)伴有內(nèi)皮細(xì)胞超氧陰離子產(chǎn)生減少［6］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Hcy可能通過活化NADPH氧化酶途徑，誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生及分泌趨化因子，從而加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程［7，8］。我們臨床試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)急性冠脈綜合癥患者血漿Hcy及MCP-1的水平顯著升高［9］。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)慢性HHcy患者血漿BH4和NO水平是顯著降低的，同時(shí)伴有CFVR水平的降低，后者在一定程度上能反映患者冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能［10］。Coppola等［4］給予 2 型糖尿病患者蛋氨酸負(fù)荷造成急性HHcy后發(fā)現(xiàn)，患者CFVR水平也是顯著降低的，這與我們的結(jié)果相一致。此外，我們的研究還發(fā)現(xiàn)血漿Hcy水平與NO、CFVR分別呈負(fù)相關(guān)性，提示慢性HHcy是引起冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能損傷的危險(xiǎn)因素。

綜上所述，慢性HHcy可能通過降低BH4的生物利用度引起eNOS脫偶聯(lián)，導(dǎo)致NO產(chǎn)生減少及冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能紊亂，最終導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)生。

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